Гибридомная технология и технология получения моноклональных антител

Текст:

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра биотехнологии

РЕФЕРАТ

На тему: «Гибридомная технология и технология получения моноклональных антител»

Студент

БТФ, 3 курса, группы 13БТ-1 Толкач Ю.Н.

Руководитель практики от кафедры

преподаватель-стажер Хомицевич А.В.

ПИНСК 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. 3

ГЛАВА 1. 5

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИБРИДОМ, МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 5

1.1 Исторические сведения о разработке гибридомной технологии. 5

1.2 Общая характеристика гибридом. 5

1.3 Общая характеристика моноклональных антител. 6

1.4 Типы моноклональных антител. 7

ГЛАВА 2. 9

ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.. 10

2.1 Способы получения антител. 10

2.2 Гибридомная технология. 10

2.3 Культивирование гибридом in vitro и in vivo. 13

2.4 Технология рекомбинантной ДНК.. 14

ГЛАВА 3. 16

ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ГИБРИДОМ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 17

3.1 Области применения моноклональных антител. 17

3.2 Перспективы и проблемы применения моноклональных антител. 18

3.3 Применение гибридом. 19

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 20

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.. 21

ВВЕДЕНИЕ

Гибридома - гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного (чаще всего мыши), и раковых клеток миеломы. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай. Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома, производящая моноклональные антитела против антигена может поддерживаться долгое время.

Наиболее перспективным направлением является гибридомная технология. Гибридные клетки (гибридомы) образуются в результате слияния клеток с различными генетическими программами, например, нормальных дифференцированных и трансформированных клеток. Блестящим примером достижения данной технологии являются гибридомы, полученные в результате слияния нормальных лимфоцитов и миеломных клеток. Эти гибридные клетки обладают способностью к синтезу специфических антител, а также к неограниченному росту в процессе культивирования. В отличие от традиционной техники получения антител, гибридомная техника впервые позволила получить моноклональные антитела (антитела, продуцируемые потомками одной-единственной клетки). Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты. Возможно получение нескольких моноклональных антител на разные антигенные детерминанты, в том числе сложные макромолекулы. Моноклональные антитела в промышленных масштабах получены сравнительно недавно. Как известно, нормальная иммунная система способна в ответ на чужеродные агенты (антигены) вырабатывать до миллиона различных видов антител, а злокачественная клетка синтезирует только антитела одного типа. Миеломные клетки быстро размножаются. Поэтому культуру, полученную от единственной миеломной клетки, можно поддерживать очень долго. Однако невозможно заставить миеломные клетки вырабатывать антитела к определенному антигену. Эту проблему удалось решить в 1975 г. Цезарю Мильштейну. У сотрудников Медицинской научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии в Кембридже возникла идея слияния клеток мышиной миеломы с В-лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной каким либо специфическим антигеном. Образующиеся в результате слияния гибридные клетки приобретают свойства обеих родительских клеток: бессмертие и способность секретировать огромное количество какого-либо одного антитела определенного типа (рис. 4.5). Эти работы имели огромное значение и открыли новую эру в экспериментальной иммунологии.

В 1980 г. Карло М. Кроче с сотрудниками (США) удалось создать стабильную, продуцирующую антигены, внутривидовую человеческую гибридому путем слияния В лимфоцитов миеломного больного с периферическими лимфоцитами от больного с подострым панэнцефалитом. Основные этапы получения гибридомной техники следующие. Мышей иммунизируют антигеном, после этого из селезенки выделяют спленоциты, которые в присутствии полиэтиленгликоля сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектными по ферментам запасного пути биосинтеза нуклеотидов - гипоксантина или тиамина). Далее на селективной среде, позволяющей размножаться только гибридным клеткам, проводят их отбор.

Питательную среду с растущими гибридомами тестируют на присутствие антител. Положительные культуры отбирают и клонируют. Клоны инъецируют животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре. Асцитная жидкость мыши может содержать до 10–30 мг/мл моноклональных антител. Гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, и в любое время вводить дозу такого клона в животное той линии, от которой получены клетки для слияния. В настоящее время созданы банки моноклональных антител. Антитела применяют в разнообразных диагностических и терапевтических целях, включая противораковое лечение (таблица 4.1). Эффективным способом применения моноклональных антител в терапии является связывание их с цитоксическими ядами. Антитела, конъюгированные с ядами, отслеживают и уничтожают в макроорганизме раковые клетки определенной специфичности.

Таким образом, работы по получению новых моноклональных антител в целях создания на их основе лекарственных и диагностических средств очень перспективны. Они позволят вывести практическую медицину на качественно новый уровень. Гибридомная технология стала прорывом в разработке препаратов для лечения злокачественных новообразований, вирусных, аутоиммунных и многих других заболеваний..
ГЛАВА 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИБРИДОМ, МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

1.1 Исторические сведения о разработке гибридомной технологии

В конце 60-х - начале 70-х годов XX в. были разработаны лабораторные методы клонирования клеток in vitro. Для этого понадобилось создать питательные среды, материалы для лабораторной посуды и термостаты-инкубаторы, позволившие имитировать условия внутренней среды организма для сохранения жизнеспособности клеток млекопитающих. В течение 10-12 лет удавалось клонировать только опухолевые клетки, поскольку их собственным свойством является способность неограниченно (в благоприятных для них внешних условиях) делиться митозом. Г. Келлер и Ц. Мильштейн в 1974-1975 гг. применили метод получения гибридных соматических клеток, который использовали цитогенетики для изучения локализации генов, контролирующих тот или иной признак в той или иной хромосоме (гибридные клетки выбрасывают большую часть хромосом, но не все), к лимфоцитам, но с иными целями. Г. Келлер и Ц. Мильштейн получили гибридные клетки из лимфоидной опухоли (миелома) и нормального лимфоцита. [15]Гибридные клетки имели часть хромосом (а следовательно, и свойств) нормального лимфоцита (другая часть хромосом выбрасывалась из клеток в течение первых делений, пока геном не стабилизировался) и часть - от опухоли. Размножались только клетки, унаследовавшие от миеломы способность к неограниченному делению. Параллельно в них шел биосинтез тех или иных продуктов нормального лимфоцита, например антител; последние и требовались Г. Келлеру и Ц. Мильштейну. Неограниченно делящиеся клетки «позволяют» себя клонировать, т.е. физически «рассадить» по одной (каждую в отдельную посуду) и получить клоны клеток - потомков одной клетки. Такие клетки назвали гибридомами.[1]

1.2 Общая характеристика гибридом

Методы гибридизации соматических (то есть неполовых) клеток широко применялись для разных целей. Дляэтого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двуядерные гибриды,которые сохраняли способность к клеточным делениям. В процессе клеточного деления хромосомыобоих ядер перемешивались и образовывали общееядро. Таким образом, возникал истинный гибрид,потомок двух соматических клеток, или гибридома.Гибридому можно получить и между нормальнойАОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой.[1]

Были использованы такие штаммы, которые не содержат фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, вследствие чего погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Лимфоциты в этой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенное антитело и способность выживать в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получают способность бесконечно размножаться in vitro. Накопившийся гибридомный клон может быть размножен. Синтезируемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве[14]

Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующие антитела одной специфичности. Все молекулы иммуноглобулинов, продуцируемые определенной гибридомой, идентичны: они относятся к одному классу и одному аллотипу, имеют одинаковые вариабельные области, структуру, идиотип, аффинность и специфичность к данному эпитопу.[16]

1.3 Общая характеристика моноклональных антител

Моноклональные антитела (МА) - это антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, т. е. произошедшими из одной клетки-предшественницы. Они могут быть выработаны почти на любое вещество, которое антитело будет специфически связывать. Их можно далее использовать для обнаружения этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко применяют в биохимии, молекулярной биологии и медицине. Если их используют в качестве лекарства. [9]

Моноклональные антитела являются мощным инструментом исследования биологических макромолекул. С их помощью изучают структуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые компоненты клеток и тканей.[7]

Анализ экспрессии и регуляции генов, идентифицированных в различных геномных проектах, требует создания тысяч и тысяч новых моноклональных антител. Моноклональные антитела позволяют обеспечить высокую специфичность, чувствительность и воспроизводимость приемов иммуноанализа и в то же время - увеличить их разнообразие и адаптировать для решения проблем фундаментального и практического характера. Поэтому создание моноклональных антител для систем иммуноанализа было и остается актуальной задачей.[18]

История открытия антител начинается с золотой эры микробиологии, с периода открытия многих возбудителей инфекционных болезней, когда врачи и ученые пытались найти лекарственные средства избирательно поражающие патогены, не нанося вреда клеткам макроорганизма.[3]

Для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтическихсредств необходимо было создать такую линиюклеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену мишени, - моноклональные антитела. Подобнаяклеточная линия могла бы стать не иссякающимисточником идентичных молекул антител.[6]

У mAb известны два механизма перекрестных иммунологических реакций с разными антигенами. В одном случае, причина кроется в антигене, и это происходит, когда разные антигены обладают одинаковыми эпитопами (например, лактатдегидрогеназа и изоцитратдегидрогеназа в области NAD-связывающего сайта). В другом случае, mAb (обычно класса IgM) сами по себе могут взаимодействовать с альтернативными антигенными детерминантами, сформированными разными остатками аминокислот. Последнее свойство иногда сильно ограничивает применение конкретных mAb для диагностики и терапии. Полиспецифичность, как правило, является свойством mAb, обладающих низкой аффинностью.[13]

Моноклональные антитела (mAb), в отличие от поликлональных, являются продуктом секреции одной антитело - продуцирующей клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся в процессе деления этой клетки. Все mAb, являющиеся продуктом одного клона, представлены идентичными молекулами, отсюда вытекают основные свойства моноклональных антител:

1) Все молекулы mAb, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковую специфичность, то есть, направлены против одинаковых мест связывания (антигенных детерминант) на каком-либо конкретном антигене, тогда как поликлональная сыворотка имеет в своем составе антитела к разным участкам связывания с антигенам и даже к разным антигенам.

2) Все молекулы mAb, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковое сродство к связываемому антигену (аффинность), то есть моноклональные антитела бывают высокоаффинными («прочно» связывающие антиген) и низкоаффинные (образующие легко диссоциирующий комплекс с антигеном). Поликлональная сыворотка всегда представлена антителами разной аффинности.

3) Все молекулы mAb, являющиеся продуктом одного клона, имеют один изотип и субизотип иммуноглобулинов, чего нельзя сказать о поликлональной сыворотке.

Все вышеперечисленные свойства mAb дают им преимущества перед поликлональными сыворотками в использовании их в диагностических целях, где mAb нашли свое самое широкое применение.[4]

1.4 Типы моноклональных антител

При применении с терапевтической целью моноклональных антител, полученных на мышиных гибридомах существует потенциальный риск иммунной реакции организма на чужеродный белок. Поэтому для снижения подобного риска были разработаны химерные, гуманизированные и одноцепочечные антитела путем сочетанного использования гибридомной технологии и технологии рекомбинантной ДНК:

а) химерные антитела. Химерные (или гибридные) антитела (chimaeric antibodies)- это антитела, в которых константный домен мышиных антител замещен соответствующим константным доменом иммуноглобулина человека. При помощи рекомбинантной технологии соединяются разнородные молекулы ДНК, кодирующие человеческий Fc-фрагмент и мышиный Fab-фрагменты антитела.

Поскольку иммуногенные и эффекторные (взаимодействие с системой комплемента, фагоцитами и др.) свойства антител определяются в основном его константным доменом, а специфичность взаимодействия с антигеном определяется вариабельным доменом, то, естественно, химерные антитела (Fc-фрагмент человеческий, а Fab-фрагмент мышиный) вызывают значительно меньше осложнений при сохранении специфичности, аффинности и авидности, свойственных мышиным моноклональным антителам;[17]

б) гуманизированные антитела. В структуре гуманизированных антител мышиное происхождение имеют только небольшие антигенсвязывающие гипервариабельные участки (CDR) вариабельного домена-Fv-фрагмента. Если у химерных антител варибельный домен полностью является мышиным, то у гуманизированных только его часть животного происхождения. Fv-фрагмент состоит из трех CDR участков (CDRI, CDRII, CDRIII).

С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза осуществляют последовательную замену только одного или двух CDR участков ДНК человека на соответствующий CDR участок ДНК мыши. Таким образом гуманизированные антитела в отличие от химерных содержат еще меньше чужеродного белка (только часть CDR мышиного происхождения) и соответственно вероятность иммунного отторжения существенно ниже. Это в основном снимает проблему иммунного ответа на введение антител больному с терапевтическими или диагностическими целями;[10]

в) одноцепочечные антитела. Наряду с полноразмерными химерными и гуманизированными антителами генная инженерия позволяет получать и одноцепочечные, мини-антитела, состоящие только из участков Fv- фрагмента (scFv). Это вариабельные домены легких и тяжелых цепей (VL u Vh) иммуноглобулина, ковалентно соединенные гибким пептидным линкером; константные домены исходного мышиного антитела полностью отсутствуют. Таким образом, одноцепочечные мини-антитела представляют собой минимальный фрагмент молекулы иммуноглобулина, который обладает достаточно хорошей антигенсвязывающей активностью.[11]

Таблица 1 –Типы моноклональных антител

Типы антител	Клетки-мишени
Химерные	Ig 1 ,aHTH-GPIIb/IIIa; IgG 1,антй-СЩ0 и CD25; Ig1,aHTH-TNFa; IgG 1,aHTH-EGFR
Гуманизированные	IgG,aHTH-CD25 и CD52; IgG 1 ,анти-1Е;IgG 1 ,анти-VEGF; IgG 1,aHTH-TNFa
Конъюгированные	IgG4,ryMaHH3.,aHTH-CD33, иммунотоксин;IgG2a, мышиный, анти-СД20, меченный иттрием-90

Примечание. TNFa - фактор некроза опухолей; EGFP - рецептор эпидермального фактора роста; VEGF - фактор роста эндотелия сосудов; СД20, СД25, СДЗЗ, СД52- поверхностные опухолевые антигены.

На текущий момент 18 терапевтических моноклональных антител одобрено FDA (Управлением по питанию и лекарствам в США). Большинство из них — антитела, полученные от грызунов, или химерные антитела. Существуют определенные правила наименования моноклональных антител. Названия всех моноклональных антител оканчиваются на «mab». Если антитело получено из мыши, добавляется буква «о», и окончание приобретает вид «omab». Химерные антитела добавляют к названию «xi» — получается «ximab», а гуманизированные антитела — окончание «zumab».[9]

ГЛАВА 2

ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

2.1 Способы получения антител

Выбор технологии получения антител зависит от его типа:

- поликлональные антитела – путем гипериммунизации;

- полноразмерные моноклональные антитела – гибридомной технологией;

- одноцепочечные, химерные, гуманизированные и конъюгированные моноклональные антитела – технологией рекомбинатной ДНК.[20]

Технологии гипериммунизации и гибридомы позволяют получать полноразмерные, двухцепочечные антитела(соответственно поли- и моноклональные). Технологии рекомбинатной ДНК позволяют получать одноцепочечные( химерные, гуманизированные, конъюгированные) антитела.

Клон, продуцирующий антитела одной специфичности - моноклональные антитела можно получить гибридомной технологией (путем гибридизации В-лимфоцитов с миеломными клетками) и технологией рекомбинантной ДНК (рекомбинацией генов, кодирующих синтез константных и вариабельных доменов антител). [3]

Моноклональные антитела можно получать также в ткани трансгенных растений либо синтетическим путем.

Трансгенные растения (чаще всего табак) используют в научно-исследовательских лабораториях для получения, как съедобных вакцин, так и моноклональных антител против новообразований (опухоли кишечника, легких и др.) и инфекций(против герпеса, бешенства, стрептококковой инфекции и др.).

Абзимы (антитела-ферменты, AntiBody enzyme) - это синтетические, каталитические антитела, способные осуществлять катализ реакций подобно ферментам. Например получены абзимы, специфически распознающие и расщепляющие кокаин, антиген ВИЧ gp41 и др.[4]

2.2 Гибридомная технология

К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимого типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью. [6]

В действительности продуцировать антитела способны только единичные гибридомные клетки. Их необходимо выделять и размножать клонированием. После тестирования клонов на способность образовывать антитела отбирают положительные культуры, которые снова клонируют и подвергают последующей селекции. В результате получают гибридому, продуцирующую моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши. Таким способом получают моноклональные антитела к определенным антигенам бактерий иливирусов, опухолевых клеток, лимфоцитов, а также к гормонам, ферментам, медиаторам и т. д.[9]

За несколько лет проблема изучения и практического использования гибридом проделала взрываподобное развитие. Сотни исследователей в различных странах подключились к ее разработке. Конечно, получение лимфоцитарных гибридом дело не простое. Оно включает в себя несколько этапов:

1. Получение миеломной линии;

2. Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма;

3. Создание в ультуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние;

4. Выделение слившихся клеток и накопление их клонов;

5. Отбор интересующего клона, его накопление и использование.

Накопление клона осуществляют in vitro или путем введения животным. При этом на всех этапах образцы клеток необходимо консервировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны. [14]

Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить монАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки, лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).[7]

Ключевая идея, лежащая в основе получения mAb(1975 г.), как и всё гениальное, очень проста: сделать бессмертным В-лимфоцит, который исходно синтезирует антитела одного вида и специфичности, но сам по себе может совершать в культуре лишь ограниченное число делений в течение 10-14 дней культивирования. Практически это достигается путем слияния первичных В-лимфоцитов, секретирующих антитела, с опухолевыми миеломными клетками, которые данной способностью не обладают, но могут неограниченно долго делиться в культуре. В результате образуются гибридные клетки (гибридомы), которые приобретают от одной из исходных клеток способность продуцировать антитела требуемой специфичности, а от другой - способность к продолжительному росту и делению в культуре. Реализация данной схемы начинается с иммунизации экспериментальных животных, как правило мышей, антигенами, против которых предполагается получать антитела. Иммуногенами могут быть препараты очищенных макромолекул, их различные смеси, а также целые клетки или субклеточные структуры. После достижения антителами в сыворотке крови мышей необходимого титра селезенку иммунизированных животных используют в качестве источника В-клеток, продуцирующих искомые антитела.

Для создания перевиваемых линий клеток свежевыделенные лимфоциты селезенки сливают в присутствии фьюзогена (полиэтиленгликоля) с опухолевыми (плазмацитомными или миеломными) лимфоцитами животного в идеале того же вида, которые могут делиться неограниченно долго. Такие иммортализованные

клетки должны обладать развитым эндоплазматическим ретикулумом и не синтезировать иммуноглобулины, кодируемые их собственными генами. Кроме того, эти клетки должны обладать чувствительностью к селектирующему агенту (аминоптерину или азасерину). Гибридные клетки (гибридомы) отделяют от исходных опухолевых клеток на селективной питательной среде HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine), содержащей указанные соединения, включая ингибитор биосинтеза нуклеотидов аминоптерин, в которой исходные миеломные клетки не могут делиться и погибают. Это происходит потому, что миеломные клетки не содержат одного из ферментов: гипоксантин-фосфо-рибозилтрансферазы (HPRT) или тимидинкиназы (ТК), необходимых для роста клеток на селективной среде. [14]

Гены данных ферментов клетки получают в результате слияния от В-лимфоцитов селезенки. Сами же клетки селезенки сохраняют свою жизнеспособность в культуре в течение 10-14 дней, после чего спонтанно погибают. Суспензию гибридных клеток распределяют по лункам 96-луночных плашек, содержащих в виде монослоя питающие клетки, которые обеспечивают гибридомы факторами роста, необходимыми для их эффективного размножения. В современном варианте культивирования питающие клетки могут быть заменены полноценными питательными средами. Выращенные таким образом в небольшом количестве культуры гибридных клеток проверяют на способность секретировать в питательную среду специфических антител и далее рассевают до отдельных клеток методом последовательных разведений. В результате, каждая клетка потенциально может стать родоначальницей клона, продуцирующего mAb требуемой специфичности.[16]

Поскольку синтез антител в ряде случаев может быть токсичным для клетки-продуцента, вместо культивирования in vitro на этой стадии параллельно используют культивирование in vivo в виде асцитных опухолей у мышей. Отмечено, что непродолжительное культивирование in vivo в дальнейшем способствует стабилизации клеточных линий, продуцирующих mAb. Полученные таким образом, охарактеризованные клоны гибридом являются источником неограниченного количества mAb данной специфичности, которые можно получать, культивируя гибридомы в искусственной питательной среде или асцитной жидкости организма мышей. [3]

2.3 Культивирование гибридом in vitro и in vivo

in vitro. Когда клетки становятся достаточно многочисленными, их переносят в лунки объемом 1-2 мл. Для этого за 2 дня до переноса гибридом в планшеты для культивирования (например, Linbro с 24 лунками) вносят ядросодержащие сингенные клетки селезенки (по 5х105 клеток в лунку). Гибридомы аккуратно суспендируют при помощи движений поршня пипетки и переносят по 100 мкл из каждой исходной лунки в 2 лунки объемом 1 мл. Начиная с 5-й недели после слияния, трижды производят замену среды (ГТ, а не ГАТ). В дальнейшем можно вести культивацию в обычной культуральной среде. [7]

В лунках объемом 2 мл гибридомы так разрастаются, что их переносят в планшеты с четырьмя лунками по 5 мл. Стабильные гибридомы можно переносить в культуральные сосуды по 25-50 мл. На этой стадии можно заменять сыворотку плода коровы нормальной сывороткой коров или лошадей. В этих сосудах среду следует также менять каждые 3-4 дня. На этом этапе можно получить достаточное количество клеток для культивирования in vivo на сингенных мышах.

Отбираемые при смене среды моноклональные антитела можно использовать для характеристики специфичности и молекулярных особенностей иммуноглобулин. В среднем концентрация моноклональных антител в культуральной среде составляет 10-50 мкг/мл.[11]

in vivo. Сингенным мышам предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл полужидкого парафина (DAB 7, VEB Leunawerke, Merseburg) или пристана (Koch-Light Lobs). Через 1-4 недели после предварительной обработки внутрибрюшинно вводят по 2х107 гибридных клеток каждому животному. В асцитической жидкости мышей концентрация моноклональных антител может достигать 5-10 мг/мл. Содержащиеся в асцитической жидкости гибридомы можно перевивать другим мышам после предварительной обработки.

2.4 Технология рекомбинантной ДНК

Получение рекомбинантных антител предполагает, во-первых, их разнообразие по специфичности взаимодействия с антигенами, соизмеримое с количеством различных клонов В-лимфоцитов в организме и, во-вторых, их промышленную продукцию, используя в качестве продуцента модифицированные микроорганизмы или эукариотные клетки.[8]

Для получения рекомбинантных антител с разной специфичностью, с различными гипервариабельными участками в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и Fv-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli; это метод фагового дисплея.

Для этого, используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК (к примеру, кодирующие CDR участки мышиных антител, полученных гибридомной технологией). Проводят раздельную ПЦР-амплификацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи. Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей. кДНК, кодирующие, сответственно Н- и L-цепи Fv-фрагмента встраивают в вектор, в геном бактериофага.[13]

Затем среди рекомбинантных бактериофагов, in vitro отбираются те, которые в большем количестве экспрессируют белок CDR, способный связываться со специфическим антигеном.Впервые возможность экспрессии одноцепочечных последовательностей, составленных из вариабельных доменов антител в составе гибридного белка оболочки нитевидного фага, была продемонстрирована еще в 1990-х годах. Рекомбинантные антитела экспонируются на поверхности репродуцировавшихся модифицированных нитевидных бактериофагов (каждый фаг несет один вариант антител). Далее эти антитела, гены которых закодированы в ДНК бактериофага-вектора, отбираются in vitro по способности взаимодействовать с антигеном.

Таким образом создание рекомбинантных антител нужной специфичности начинается с получения библиотеки клонов ДНК, встроенных в соответствующее число бактериофагов. Затем проводится биопаннинг (biopanning) - селекция бактериофагов, обладающих большей аффинностью к иммобилизованным лигандам (специфическим антигенам). Биопаннингом или аффинной селекцией можно существенно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать фаги, несущие гены, кодирующие синтез мини-антителс нужными свойствами. Число клонов ДНК в составе одной фаговой библиотеки, созданной технологией фагового дисплея способно кодировать синтез разной специфичности антител, соизмеримых с их разнообразием в организме млекопитающего.[19]

Метод фагового дисплея, относящийся к технологии рекомбинантной ДНК в отличие от гибридомной технологии позволяет существенно повышать аффинность синтезируемых антител (оптимизировать сайты связывания с антигеном). Дополняя биопаннинг повторением циклов отбора бактериофагов с использованием мидификации генов (использование ошибающейся полимеразы или ПЦР-мутагенез, либо применяя направленный ПЦР-мутагенез гипервариабельных петель антител) можно еще более повысить аффинность и создать более эффективно связывающиеся антитела.

Например, с помощью фагового дисплея получены антитела к аутоантигену - фактору некроза опухоли альфа (применяются эти антитела как антиревматоидное средство), к тканевому фактору роста бета (для терапии фиброзных болезней в офтальмологии), к опухолевому антигену и т.д. С целью продукции рекомбинантных антител, модифицированную кДНК встраивают в векторы экспрессии и трансформируют ими подходящие клетки-хозяева (микроорганизмы,чаще E.coli или клетки млекопитающих).[12]

Для синтеза полноразмерных рекомбинантных антител векторы экспрессируют в клетках млекопитающих. Только в эукариотических клетках возможна правильная сборка белковой молекулы и гликозилирование, необходимое для выполнения антителами эффекторных функций. Так, в лимфоидных клетках экспрессия химерных антител находится под контролем естественной системы регуляции - промоторы, энхансеры, факторы транскрипции.Подобные системы регуляции в прокариотных клетках отсутствуют. Полученный в результате отбора клон лимфоцитов, продуцирующий рекомбинантные антитела культивируется в биоректоре.

В современных технологиях используются биореакторы с полыми волокнами, стенки которых образованы полупроницаемыми мембранами. По волокнам циркулирует культуральная среда, компоненты которой проникают через полупроницаемые мембраны в основной отсек, где находятся культивируемые клетки, в нем собираются синтезируемые антитела, они не проникают через полупроницаемую мембрану. Важным преимуществом данного метода культивирования является сравнительно высокая концентрация конечного продукта - антител Собранная культуральная среда, содержащая продуцированные клетками антитела, подвергается очистке аффинной, ионообменной и гельпроникающей хроматографией, чтобы получить высокоочищенные белки - антитела.[3]

ГЛАВА 3

ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ГИБРИДОМ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

3.1Области применениямоноклональных антител

Моноклональные антитела и пропроизводные на их основе, находят широкое применение во многих областях современной биологии и медицины. Оборот mAb на мировом рынке в 1998 г. превышал три млрд долларов. Практическое использование mAb продолжает расширяться, хотя структура рынка непрерывно меняется, что связано с постоянным внедрением новых технологий, в частности, ПЦР, которая при той же информативности является во многих тестах гораздо более чувствительной, чем иммунологические методы.[5]

Прежде всего, mAb являются прекрасным инструментом количественного и качественного иммуноферментного (ИФА) и радиоиммунологического (РИА) анализа антигенов любого происхождения. Особо следует отметить их незаменимость в исследовании системы маркеров дифференцировки клеток (CD-маркеров -cluster of differentiation (CD) system) в иммунологии. В настоящее время известно более 200 таких маркеров, и по их присутствию на поверхности клеток в разных сочетаниях делают обоснованные выводы о состоянии иммунной системы организма: стадиях дифференцировки клеток иммунной системы, уровне их активации и т.п. С помощью проточной цитометрии и флуоресцентномеченых mAb удается наблюдать за динамикой различных субпопуляций лимфоцитов во время иммунного ответа организма, определять иммунодефицитные состояния, а также диагностировать онкологические заболевания и следить за эффективностью терапии.

Для обнаружения комплекса антиген-антитело в ИФА, как правило, используют цветные реакции, однако данный подход может быть легко адаптирован к детекторам флуоресценции или биоэлектронным приборам (биосенсорам). Биосенсоры, созданные на основе mAb, успешно применяются для непрерывного мониторинга окружающей среды, биотехнологических процессов, а также внутренней среды организма человека и животных.[8]

Отдельная большая область применении mAb - это их использование в качестве лекарственных средств. Первыми mAb, которые были допущены в США к применению в клинике, были ОКТЗ. Эти мышиные mAb блокируют все Т-клетки, экспрессирующие на своей поверхности комплекс CD3. Они успешно используются для подавления острой реакции отторжения трансплантата при пересадке органов. Поскольку их действие основано на иммуносупрессии, они не вызывают иммунного ответа в организме человека. Антитела к антигенам CD2, CD5, CD7 и CDw52, a также к цитокинам и их рецепторам проходят клинические испытания для лечения аутоиммунных заболеваний. Целью применения данных mAb является специфическое удаление конкретных субпопуляций клеток иммунной системы таким образом, чтобы обновленный организм не утрачивал способности противостоять обычным инфекциям.

Использование mAb в качестве антибактериальных агентов и средств, направленных против бактериальных эндотоксинов, сдерживается их высокой стоимостью, поэтому во многих случаях проблема решается применением высокоэффективных и дешевых антибиотиков. Однако последние не могут быть использованы при развитии у бактерий лекарственной устойчивости. В этой связи, перспективным лекарственным средством может оказаться IgG человека, специфичный в отношении липида А, одного из основных компонентов липополисахаридных эндотоксинов бактерий. Такие mAb успешно применяют при сепсисе новорожденных, а также при сепсисе, возникающем у пациентов после оперативного вмешательства.[10]

3.2 Перспективы и проблемы применения моноклональных антител

Пути повышения эффективности терапии моноклональными антителами:

-продукция антител, не вызывающих ответную иммунную реакцию, высокоспецифичные по действию, а при диагностике лучше малые по размеру (in vitro в биочипах, in vivo в липосомах, маркеры опухолей и др.);

-получение биспецифических антител, они одним плечом гипервариабельного домена связываются с поверхностным антигеном опухолевой клетки, а другим с антигенным рецептором Т-лимфоцитов, что обеспечивает их тесный контакт;

-снижение их иммуногенности: химерные и гиперхимерные(гуманизированные) антитела с разным соотношением мышиного

и человеческого белка;

-перспективны технологии доставки лекарственных препаратов при помощи конъюгатов противоопухолевых антител с ферментом, расщепляющим лекарственный предшественник, превращая его в лекарство только в непосредственной близости к клеткам-мишеням.

Наиболее важными проблемами, мешающими эффективному использованию моноклональных антител являются гетерогенность опухолевой массы, изменчивость антигенной структуры патогенных вирусов и бактерий, и слабая иммуногенная активность, аффиность антител. Гетерогенность опухоли означает, что далеко не все опухолевые клетки могут содержать антиген, против которого направлено данное специфическое антитело. Кроме того, вследствие генетической нестабильности в опухолевых клетках часто происходят мутации, в том числе связанные с поверхностными антигенами. В результате часть клеток легко «ускользает» от терапевтического действия данного моноклонального антитела.

Подобная ситуация может возникать и с антигенами микроорганизмов (например, высокая изменчивость поверхностных антигенов ВИЧ, гриппа и др.). Недостаточная иммуногенность или низкая аффиность антител также значимый фактор, особенно это касается неполноразмерных антител.[15]

3.3 Применение гибридом

Гибридомы создают уникальные возможности в аналитических целях: их можно применять как “иммунологический микроскоп” с чрезвычайно высоким разрешением. Благодаря гибридомам его можно не только обнаружить, но и вывести в линию и получить любое количество соответствующих антител. С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей. Такие моноклональные антитела нашли широкое применение в онкологической клинике.[9]

Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории. Гибридомы сделали реальностью предполагаемые клоны антителообразующих клеток и позволили даже обнаружить их существование в организме до введения соответствующего антигена. Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей.[2]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Опубликование в 1975 году статьи, в которой было описано слияние нормальных плазмацитов с их опухолевыми аналогами - клетками миеломы и последующий отбор клонов-продуцентов антител, открыло эру создания, исследования и использования моноклональных антител. Совокупность приемов получения штаммов-продуцентов моноклональных антител была основана на гибридомной технологией. В ее основе лежит синтез ряда достижений клеточной биологии, фундаментальной иммунологии и экспериментальной онкологии.

Почти все новации в получении моноклональных антител имели своей целью создание человеческих терапевтических антител. Впервые моноклональные антитела стали использоваться в терапии в 1986 году, но из-за своего мышиного происхождения их применение было очень ограничено. Спустя почти два десятка лет использование моноклональных антител в терапии остается в зачаточном состоянии, несмотря на очевидные успехи в этом направлении. Большим сдерживающим фактором здесь является высокая стоимость производства терапевтических количеств моноклональных антител. Последние новости о работах по созданию трансгенных промышленных животных (коз, овец, коров), продуцирующих человеческие антитела в своем молоке, вселяют надежду на более широкое использование моноклональных антител для лечения инфекционных, опухолевых и аутоиммунных заболеваний.

Гибридомная технология позволяет получать практически неограниченное количество моноклональных антител практически на любой существующий антиген. Эта методика по своим масштабам не имеет конкуренции и является лидером по коммерческому обороту. Перспективность гибридомной технологии для развития методов иммуноанализа была высоко оценена исследователями, и лаборатории многих стран мира занялись ее освоением и адаптацией.

Таким образом, совершенствование ряда ключевых этапов гибридомной технологии представляет собой актуальную задачу, так как получаемые в результате моноклональные антитела широко используются во многих областях медицины и биотехнологии.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Абелев Г.И.Основы иммунитета // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 5. С. 4–10.

2. Алмагэмбетов К.Х.. Биотехнология. - Астана, 2011.- 270 с.

3. Алмагамбетов К.Х. Медицинская биотехнология. - Астана, 2009. – 236 с.

4. Баев, А.А. Биотехнология /Под ред. А. А. Баева. - М., 1984. – 325 с.

5. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. Использование в диагностике заболеваний и лечебные моноклональные антитела. [Текст]: Методические рекомендации для студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического факультетов. – Тверь, 2012г.- 22 с.

6. Глик, В. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение /Пер. с англ. Н.В.Баскаковой и др. / В Глик - М.:Мир, 2002. - 589 с.

7. Егоров, Н.С. Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов / Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Высшая школа, 1987. – 139 с.

8. Елинов, Н.П. Основы биоехнологии / Н.П. Елинов. – СПб.: Наука, 1995. – 600с.

9. 3агоскина Н.В. Биотехнология: теория и практика: Учеб. пособие для вузов/Н.В. Загоскина, Л.В. Назаренко, Е.А. Калашникова, Е.А. Живухина-; Под ред. Н.В. Вагоскиной, Л.В. Назаренко.- М.: Издательство Оникс, 2009. - 496 с.

10. Кеннет Р.Г.Мак-Керн Т.Дж.,Бехтол К.Б Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. М.: Медицина, 1983г. – 416с.

11. Кефели, В.И., Дмитриева, Г.А. Биотехнология: курс лекций / В.И. Кефели, Г.А. Дмитриева - Пущино, 1989г. – 143 с.

12. Ковальчук Л. В. Иммунология / Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской // учеб. Пособие- М. : ГЭОТАР- Медиа, 2010. - 176 с.

13. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы / Л. И.Патрушев. - М.: Наука, 2004.- 530с.

14. Петров Р.В. Иммунология.- М.: Медицина, 1987.- 416с.

15. Ройт А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991.- 328с.

16. Самойлович М. П. Совершенствование гибридомной технологии и создание моноклональных антител для систем иммуноанализа//Санкт-Петербург, 2006.- 238 с.

17. Свешников П.Г. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию./ Свешников П.Г., В.В. Малайцев, И.М. Богданова, Солопова О.Н.// Издательство МГУ. М.- 2006.

18. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 194 - 205.

19. Хиггинс, И. Биотехнология - принципы и применение /под ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса. - М., 1988. – 405 с.

20. Чиркин А.А. Основы генной инженерии: методы рекомбинантных ДНК. Учебно-методический комплекс для студентов биологического факультета (издание второе исправленное и дополненное). УО «ВГУ им. П.М. Машерова», 2005. -136с.