История лаборатории химиопрофилактики и онкофармакологии и специфика её методологии

Текст:

НИИ ОНКОЛОГИИ ИМ. Н.Н. ПЕТРОВА

РЕФЕРАТ

для сдачи кандидатского экзамена

по истории и философии науки на тему:

«История лаборатории химиопрофилактики и онкофармакологии и специфика её методологии»

Выполнил

аспирантлаборатории

химиопрофилактики рака

и онкофармакологии

специальности

14.01.12 - онкология

Жабин Александр Алексеевич

Ознакомлен: научный руководитель/

зав. кафедрой: ____________________________________________

Ф.И.О., роспись

Санкт-Петербург, 2012

СОДЕРЖАНИЕ

1. История лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии………………………………………………………………..2

2. Особенности методологии экспериментальной химиотерапии опухолей………………………………………………………………………….11

3. Медико-этические проблемы экспериментальной медицины. ………..24

История лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии [1]

Лаборатория химиопрофилактики рака и онкофармакологии занимается поиском, изучением и внедрением в клиническую практику эффективных препаратов для лечения опухолей, а также средств, предупреждающих их возникновение и развитие; проводит фармакологические и токсикологические исследования лекарственных препаратов. Лаборатория продолжила такого рода исследования, традиционно проводившиеся в НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова более 60 лет, в результате чего был разработан ряд новых оригинальных противоопухолевых препаратов, а также препаратов для химиопрофилактики рака, которые применяются в клинической практике или проходят доклиническое и клиническое изучение.

Становление противоопухолевой химиотерапии в России и на территории бывшего СССР неразрывно связано с НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова. Ныне существующая лаборатория химиопрофилактики рака и онкофармакологии исторически связана с лабораторией экспериментальной терапии рака, которая была организована в Ленинградском институте онкологии профессором Леонидом Фёдоровичем Ларионовым в 1945 г.

Эта была первая в стране лаборатория, в которой на животных с перевиваемыми экспериментальными опухолями проводился поиск противоопухолевых препаратов из группы антиметаболитов и галоидалкиламинов. Сотрудниками лаборатории Н.И. Вольфсоном и Л.Л. Малюгиной в 1946 г. было начато изучение свойств антиметаболитов пиримидинов и пуринов. Эти исследования представляли собой новое направление в химиотерапии рака, так как первые сообщения американских авторов о производных пуринов появились позднее, в 1949 г. Еще одно новое направление – использование метаболитов в качестве носителей цитотоксических групп. В 1946 г. в ходе изучения противоопухолевых свойств галоидоалкиламинов Л.Ф. Ларионовым и его сотрудниками выявлен, детально изучен, а затем внедрен в клиническую онкологическую практику нашей страны препарат эмбихин, за что его авторы – химик-синтетик В.Г. Немец и Л.Ф. Ларионов – в 1951 г. были удостоены Государственной премии СССР. Эмбихин до настоящего времени входит в состав эффективных схем химиотерапии опухолей. Под руководством Л.Ф. Ларионова проводилось изучение гомологов и аналогов эмбихина (Г.Л. Жданов, Т.Э. Птицина, С.А. Папоян, Н.И. Вольфсон), вскоре приведшее к созданию препарата новоэмбихин, который менее токсичен по сравнению с его предшественником.

В связи с переводом Л.Ф. Ларионова в Москву в 1951 г. подразделение было преобразовано в лабораторию экспериментальной онкологии, руководителем которой до 1959 г. был профессор Леон Манусович Шабад. В течение этого времени работы по экспериментальной терапии опухолей были существенно ограничены, а превалировали исследования канцерогенеза.

В 1959 г. лабораторию возглавил профессор Николай Васильевич Лазарев, который ориентировал деятельность лаборатории на разработку методов лечения и профилактики опухолей. В 1965 г. это структурное подразделение в соответствии с решаемыми задачами стало называться лабораторией лекарственных методов профилактики и терапии злокачественных новообразований. С именем Н.В. Лазарева и его многочисленных учеников связаны новые направления в терапии рака и предопухолевых заболеваний. Н.В.Лазарев – основоположник учения о неспецифически повышенной сопротивляемости организма и адаптогенах – веществах стимулирующих это состояние, а также их значении в профилактике и лечении злокачественных опухолей. Под руководством Н.В. Лазарева были синтезированы новые производные пиримидинов (Р.С. Карлинская), впервые начаты работы по антиканцерогенезу, проведены успешные исследования по профилактике опухолевой трансформации некоторых факультативных предраковых состояний – язвы желудка, лучевых поражений кожи и слизистых оболочек (А.А. Акимов, Ш.У. Исмаилов), внедрены в клиническую практику препараты пентоксил и метилурацил, адаптогены (элеутерококк, женьшень и др.). Сотрудниками лаборатории впервые выявлены принципиально важные эффекты: возможность ингибирования химического канцерогенеза, используя адаптогены (Ф.К. Джиоев) и производные пиримидинов (Б.М. Лабковский); способность адаптогенов повышать эффективность цитостатической терапии (А.Н. Стуков) и снижать ее токсичность (А.И. Миронова, И.П. Сержанин, И.А. Студенцова, Б.В. Монахов); установлена антиметастатическая активность адаптогенов (Л.Л. Малюгина, К.В. Яременко, Е.В. Цырлина) и пиримидинов (Б.М. Лабковский, Д.А. Асадов). Проводились успешные исследования по радиосенсибилизирующему действию пиримидинов и их потенцирующему влиянию на эффект химиотерапии (Р.И. Полькина); впервые обнаружена антилейкозная активность нормальных метаболитов пиримидинового обмена (Г.И. Фелистович).

Н.В.Лазарев понимал, что без собственной синтетической базы создание новых препаратов не может быть эффективным и успешным, и подчеркивал, что биологи и медики должны на стадии проектирования новых потенциально активных соединений тесно взаимодействовать с химиками-синтетиками. Именно ему принадлежит идея создания в институте лаборатории органического синтеза, первым руководителем которой стал талантливый химик профессор Александр Львович Ремизов. Под руководством А.Л. Ремизова и при его непосредственном участии синтезированы ряд оригинальных препаратов. В частности, создан вошедший в практику препарат хромолимфотраст, позволявший визуализировать регионарные лимфатические узлы и лимфатические сосуды в операционном поле (А.Л. Ремизов, В.А.Филов, Б.А. Ивин и др.) А.Л. Ремизову принадлежит идея целенаправленного синтеза потенциальных противоопухолевых препаратов, обладающих заранее заданными свойствами, такими как реакционная способность и гидрофильно-гидрофобный баланс. Плодотворность идеи А.Л. Ремизова об избирательности противоопухолевого действия цитотоксических соединений, определяемой их физико-химическими характеристиками, была успешно подтверждена созданием оригинального противоопухолевого препарата диоксадэт (этилениминотриазин) (Б.О.Крайз). Особенность диоксадэта состоит в выраженном контактном действии из-за высокой химической реактивности, благодаря чему препарат оказался высокоэффективным для лечения осложненных асцитом опухолей яичника и молочной железы. Кроме того, интерес к диоксадэту чрезвычайно высок, благодаря возможности эффективно использовать препарат в таких технологиях, как химиоэмболизация метастатически пораженных органов (печень, почки и др.), а также химиоперфузии, что было показано в 90-е годы 20 века (А.В. Воробьев, М.Л. Гершанович, А.М. Гранов и др.). В эти же годы препарат был разрешен для медицинского применения Фармкомитетом Минздравмедпрома РФ в качестве противоопухолевого средства при раке яичников, молочной железы, легкого, почки, печени и для предупреждения регионарного метастазирования при раке полости рта. В 1971 г. лабораторию лекарственных методов профилактики и терапии злокачественных новообразований возглавил профессор Владимир Александрович Филов, который к этому времени был одним из ведущих токсикологов в нашей стране. Деятельность лаборатории осуществлялась в тесном сотрудничестве с лабораторией органического синтеза, руководство которой перешло к профессору Борису Александровичу Ивину (впоследствии лаборатории были объединены в одну – лабораторию органического синтеза, онкофармакологии и токсикологии). С этого периода активизировалась работа по скринингу новых групп соединений на противоопухолевую активность. Было синтезировано и подвергнуто испытаниям свыше 800 новых потенциально активных противоопухолевых соединений из различных классов, в частности производных пуринов и пиримидинов, азиридинилтриазинов, кремнийорганических соединений, оксазинов и триазинов. В синтезе противоопухолевых препаратов принимали участие Б.О. Крайз, В.В. Белогородский, Ю.С. Финогенов, Ж.В. Белодедова, С.А. Коньков, А.С. Петров, а в изучении их биологических свойств – Л.Л. Малюгина, Р.И. Полькина, Н.Р. Мюллер, А.Н. Стуков, А.И. Колосов.

Сотрудниками лаборатории охарактеризована возможна роль лизосом в лекарственном лечении злокачественных опухолей (В.А. Филов, А.В. Третьяков, Е.М. Рязанов). С успехом разрабатывались способы снижения токсичности противоопухолевых средств, изучались подходы к комбинированному применению различных противоопухолевых препаратов (А.Н. Стуков). Широко изучались возможные механизмы действия противоопухолевого действия препаратов (А.В. Третьяков, В.В. Резцова).

Всегда важным разделом работы подразделения было обеспечение внедрения перспективных препаратов в клинику: подготовка необходимой документации, а также наработка субстанции и лекарственных форм, допущенных к медицинскому применению препаратов, в частности диоксадэта, СЭАФТ (соль этаноаминовая 6-фторурацила), мерадина (6-меркаптоаденин; эффективный стимулятор регенерации, разрешенный к применению при язве желудка) и других.

В конце 1981 года в институте был создан отдел химии, биологии и токсикологии противоопухолевых средств (руководитель – проф. В.А. Филов), в состав которого вошли лаборатория органического синтеза, онкофармакологии и токсикологии и лаборатория предклинических испытаний (руководитель – профессор Валерий Анатольевич Александров). В.А. Александров, будучи высококвалифицированным специалистом в области пренатальной токсикологии, как международный эксперт участвовал в разработке методологии оценки вредного действия химических веществ на эмбриональный организм, изложенной в рекомендациях ВОЗ 1984 г., являлся одним из авторов Методических указаний по испытанию лекарственных препаратов на эмбриотоксичность. В.А. Александров и его сотрудники (В.Г. Беспалов, И.Г. Попович. А.Г. Ушморов и др.) участвовали в проведении доклинических испытаний ряда лекарственных препаратов, разрешенных впоследствии Минздравом РФ для клинического применения или проходящих регистрацию в Минздраве РФ.

Лаборатория химиопрофилактики рака и онкофармакологии как новое структурное подразделение создана в институте в 2008 году. Лаборатория объединила сотрудников после реорганизации отдела химии, биологии и токсикологии противоопухолевых средств. Возглавил лабораторию доктор медицинских наук Владимир Григорьевич Беспалов. В штате лаборатории трудятся специалисты нескольких специальностей: врачи, фармакологи, биологи, а также химики, перед которыми поставлена цель решать комплексные задачи по разработке, изучению и внедрению в клиническую практику новых лекарственных препаратов, предназначенных как для терапии опухолей, так и химиопрофилактики рака, а также разработке новых технологий, повышающих эффективность химиотерапии.

К настоящему времени на различных моделях опухолей изучено более 60 веществ, и из них более 50 проявило антиканцерогенную активность. В результате проведенной работы впервые выявлен ряд новых антиканцерогенных веществ, у известных ингибиторов установлена способность тормозить развитие опухолей ранее неизвестных локализаций.

Доклиническое и клиническое изучение противоопухолевой активности фармакологических веществ и препаратов

В последние годы были пересмотрены результаты изучения ранее синтезированных противоопухолевых препаратов, чтобы выявить наиболее перспективные для внедрения в клиническую практику после более углубленного и широкого экспериментального исследования. Наибольший интерес привлекли два препарата: диоксадэт и хлонизол.

Диоксадэт относится к группе алкилирующих соединений – этилениминов. В лаборатории были разработаны новая схема синтеза фармацевтической субстанции и новая лекарственная лиофилизированная форма препарата, которые обеспечивают большую безопасность в производстве; разработан новый проект ФСП на лекарственную форму; проведены доклинические исследования по оценке противоопухолевой активности диоксадэта на стандартных моделях трансплантированных опухолей в сравнении с цитостатиками, применяемыми в клинической практике.

В доклинических исследованиях была установлена выраженная противоопухолевая активность диоксадэта на широком спектре перевиваемых опухолей у лабораторных животных. Данные сравнительного изучения диоксадэта свидетельствуют о его более высокой противоопухолевой активности, чем у наиболее близкого к нему по структуре тиофосфамида. В эксперименте на крысах с перевиваемой асцитной опухолью яичника противоопухолевое действие диоксадэта при внутрибрюшинном введении сравнимо с действием цисплатина, являющегося стандартом в клинической интраперитонеальной химиотерапии рака яичника. С учетом того, что диоксадэт, в отличие от препаратов платины, обладает значительно более низкой токсичностью, не вызывает осложнений в виде спаечного процесса, перспективным является применение диоксадэта для интраперитонеальной химиотерапии рака яичника. В экспериментах с асцитной опухолью Эрлиха у мышей выявлен выраженный синергизм противоопухолевого действия диоксадэта в комбинации с гемцитабином при отсутствии повышения токсичности.

Клинические испытания диоксадэта по II фазе были проведены в 15 онкологических учреждениях у 229 больных распространенными формами злокачественных новообразований различных локализаций. Несмотря на то, что все больные были с далеко зашедшими формами злокачественных новообразований, практически при всех локализациях был доказан объективный противоопухолевый эффект диоксадэта. Особенно сильным противоопухолевый эффект диоксадэта оказался в лечении распространенных форм рака яичников и молочной железы, в том числе у больных с асцитом и ранее леченных другими алкилирующими агентами. Были проведены клинические испытания диоксадэта в качестве противоопухолевого средства для химиоэмболизации при операбельных и распространенных формах рака почки. Химиоэмболизация с диоксадэтом повышала 2- и 3-летнюю выживаемость больных неоперабельным раком почки. Были проведены клинические испытания диоксадэта в качестве противоопухолевого средства для химиоэмболизации печеночной артерии у больных с первичным раком печени и метастазами в печень колоректального рака. Была доказана эффективность химиоэмболизации с диоксадэтом в виде получения объективного противоопухолевого ответа и увеличения выживаемости больных.

Накопленный опыт, кадры и материально-техническая база позволяют лаборатории проводить поиск, изучение и внедрение в клиническую практику эффективных препаратов для химиопрофилактики рака и противоопухолевых препаратов по следующим направлениям.

1. Синтез фармацевтических субстанций; разработка рецептур, технологических регламентов, фармакопейных статей, нормативной документации на лекарственные препараты.

2. Доклиническое изучение антиканцерогенной активности веществ на химически индуцированных опухолях у животных, моделирующих основные локализации злокачественных опухолей человека.

3. Доклиническое изучение противоопухолевой активности фармакологических веществ, а также средств, способных препятствовать рецидивированию, метастазированию, и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей на моделях трансплантируемых опухолей у животных.

4. Доклиническое изучение средств, способных уменьшать токсичность противоопухолевых препаратов.

5. Доклинические исследования безопасности фармакологических веществ и лекарственных средств: изучение общетоксического действия, оценка канцерогенности, изучение репродуктивной токсичности.

6. Клиническое изучение препаратов для лечения предраковых состояний и изменений и снижения риска онкологических заболеваний.

7. Разработка новых лекарственных форм противоопухолевых препаратов, разработанных в лаборатории, с использованием нанотехнологий. Доклиническое изучение возможностей применения противоопухолевых препаратов в высокотехнологичных методах лечения рака, таких как нормотермические и гипертермические химиоперфузии. Внедрение разработанных противоопухолевых лекарственных препаратов в клиническую практику.

Лаборатория по данным направлениям работы широко сотрудничает с научными, диагностическими и клиническими подразделениями НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, научно-исследовательскими и практическими медицинскими организациями, фармацевтическими компаниями России и зарубежья.

Особенности методологии экспериментальной химиотерапии опухолей [2]

Прогресс в области лекарствоведения привел к тому, что выделился и в той или иной степени обособился ряд научных дисциплин и направлений. К ним относятся, помимо экспериментальной и клинической фармакологии, фармация, токсикология, химиотерапия инфекций, химиотерапия опухолевых заболеваний и др. Химиотерапия опухолевых заболеваний является относительно молодой отраслью онкологии. Несмотря на сравнительно короткий срок существования, она достигла известных успехов как в эксперименте, так и в клинике и продолжает быстро развиваться. Фармакология как наука о взаимодействии между химическими агентами и живым веществом относится к биологии и требует тех же методологических подходов, как и другие разделы биологии. Действие лекарственных веществ и ядов познаваемо, как и всякий другой процесс, происходящий в материальном мире.

Однако фармакология имеет некоторые отличия от родственных ей дисциплин, особенно физиологии и биохимии, - отличия, требующие методологического обсуждения. Существенным и характерным для фармакологии отличием является то, что она не ограничивается наблюдением и регистрацией явлений, протекающих в живых существах, но непременно изучает результаты воздействия на них химических веществ.

Воздействие химических веществ на процессы, протекающие в живых объектах, т.е. фармакологический метод, используется нередко в физиологии и особенно в биохимии, но при этом целью является выяснение характера биохимических процессов, протекающих в изучаемых объектах, или вида химических структур, в них участвующих. Конечной же целью фармакологии всегда является сам результат воздействия химическим веществами, т.е. направленное влияние фармакологических агентов на жизненные процессы.

Активное вмешательство фармакологическим веществами в жизненные процессы производится на основании имеющейся о них информации. Иначе говоря, для того, чтобы направленно влиять фармакологическим веществами на жизненные процессы и вмешиваться в их течение, надо предварительно иметь представление о их биохимической сущности. Результаты же фармакологического вмешательства составляют в свою очередь содержание информации, получаемой фармакологией, и, таким образом, последняя содержит элементы сложного процесса, заключающего в себе как бы два этапа этого процесса.

Возможность направленного воздействия фармакологическими веществами на организм в эксперименте и в клинике служит подтверждением на практике объективности теоретических представлений, составляющих предмет фармакологии. Ставя своей целью получить направленный результат воздействия, фармакология ищет вещества, обладающие наиболее выраженным намеченным эффектом. Задача современной фармакологии – не только изучать механизм воздействия фармакологических веществ на организм, но и изыскивать и создавать новые биологически активные вещества.

Создание новых биологически активных веществ основано на изучении связи между строением химических веществ и их действием, что осуществляется экспериментальным путем, является результатом синтеза, над которым в содружестве работают химики-синтетики и фармакологи. Их совместный творческий труд приближает нас к пониманию связи между строением и действием фармакологических агентов. Современнная фармакология устанавливает эту связь, учитывая строение фармакологических веществ и предположения о структуре тех частей макромолекул живого объекта, с которыми вступает в связь изучаемый агент.

Усовершенствование методов исследования и углубление теоретических подходов повышает качество информации, обогащая наши знания и приближая к более полному познанию действительности. Благодаря развитию науки о строении атомов и созданию методов, позволяющих определять положение их электронов, мы существенно обогатили наши представления о связи между строением фармакологических веществ и их действием. Известно, что в молекуле происходит смещение электронов, принадлежащих атомам, входящих в состав молекулы, что вызывает смещение «электронного облака». Этот сдвиг создает в определенных частях молекулы неполные заряды. Неполные заряды принимают важное участие в образовании связей между молекулами фармакологического вещества и макромолекулой живого объекта. При синтезе новых соединений возможные сдвиги электронного облака подсчитываются с помощью ЭВМ.

Важное значение в процессе изучения взаимодействия между фармакологическим агентом и живым субстратом имеет проникновение в структурные особенности тех молекул субстрата (молекулы-мишени), с которыми реагирует данный агент. Поскольку фармакологический агент как химическое соединение вмешивается в биохимические процессы, молекулы-мишени, естественно, представляются как реактивные биохимические субстанции. При современных знаниях мы в большинстве случаев можем достаточно точно установить структуру биологических макромолекул, которые вступают в реакцию с фармакологическим агентом, однако учесть все возможные взаимодействия до сих пор представляется затруднительным.

Современные достижения точных наук открывают для фармакологии возможность более полного познания взаимодействия между фармакологическим веществом и живым субстратом. Это непосредственное взаимодействие принято называть первичной фармакологической реакцией, на изучение которой направлены усилия ученых. Важный вклад в решение этих вопросов вносит биохимическая и внутриклеточная фармакология, пользующаяся электронной микроскопией, мечеными атомами и наблюдениями над клеточными органеллами. Существенную роль играет фармакодинамика, изучающая движение и превращение лекарственных средств в организме, что имеет особое значение, так как отличительной чертой фармакологического процесса является неизбежное изменение как фармакологического агента, так и живого субстрата при их взаимодействии. При проникновении фармакологии на субклеточный молекулярный уровень обнаруживается единство формы и содержания, т.е. структуры и функции. Еще недавно в медицинской науке, в том числе в фармакологии, было принято отличать функциональные изменения от структурных и допускалось, что функциональные изменения могут наступать без изменений структурных. Современная клеточная морфология рассеяла этот миф и доказала, что всякие функциональные изменения, вызываемые фармакологическим агентом, сопровождаются ультраструктурными изменениями.

Изучение действия лекарственных веществ на молекулярном уровне требует математического анализа соотношения между дозой и эффектом, для чего служат опыты на простейших объектах – изолированных органах. Однако такой анализ должен непременно быть объединен с синтезом в опытах на целом организме, памятуя о взаимосвязи частей с целым организмом и последнего со средой. Фармакология, основанная на учении И.П. Павлова, - главный и закономерный путь фармакологов, вооруженных философией диалектического материализма. Для павловской фармакологии, т.е. для фармакологии целостного огранизма, первостепенное значение имеет нейрофармакология – изучение действия лекарственных веществ на нервную систему, которая обеспечивает взаимосвязь всех частей организма и их взаимоотношение со средой.

При развитии фармакологических знаний неизбежно появление противоречий, преодоление которых ведет к прогрессу этой науки, т.е. к дальнейшему приближению познания сущности процессов взаимодействия «лекарство-организм». Новые факты, противоречащие прежней теории, ведут к последующему развитию науки. Практика как критерий правильности теоретических заключений имеет решающее значение в фармакологии. Окончательным показателем истинности теории служит объективный учет лечебного действия препаратов, предлагаемых на основе эксперимента.

Эксперимент (от латинского «experimentum» - проба, опыт) означает научно поставленный опыт, иными словами – наблюдение вызванного явления в точно учитываемых условиях, позволяющих не только следить за его ходом и управлять им, но и воссоздать его его каждый раз при повторении этих условий [3]. В науке эксперимент является одним из основных способов познания и преобразования действительности. От натурного наблюдения его отличает активное воздействие экспериментатора на объект изучения. На эту характерную черту экспериментального исследования весьма образно указал И.П. Павлов: «Наблюдение собирает то, что ему предлагает природа, опыт же берет у природы то, что он хочет». Клод Бернар также считал, что опыт есть не что иное, как «наблюдение, вызванное с целью проверки», причем к опыту нужно «прибегать лишь тогда, когда наблюдение, которое следует вызвать, не существует совершенно готовое в природе».

Исследователь в процессе эксперимента, опираясь на имеющиеся знания и сведения об объекте исследования и определенную избранную им теорию, влияет должным образом на условия, в которых существует данный объект, на конкретные его стороны и свойства с тем, чтобы выяснить их истинную природу и определить направления и тенденции возможного их развития в последующем. В результате этого исследователь может более глубоко выяснить отдельные стороны и свойства изучаемого объекта и на этой основе осознать сущность и возможные изменения в нем.

Следует также отметить, что технические средства экспериментальных исследований служат либо для прямого воздействия на исследуемый объект, либо для целенаправленного изменения условий, в которых он должен функционировать. Иными словами, экспериментатор, применяя различные аппараты, установки и приборы, стремится изменить или преобразовать исследуемые материальные предметы или процессы в интересах более глубокого и всестороннего их познания.

К наиболее характерным чертам эксперимента обычно отностя то, что он: «а) дает возможность сознательно расчленять предмет исследования с целью изучения отдельных его сторон, особеннойстей и тенденций развития в “чистом” виде; б) не ограничен параметрами времени и пространства: исследователь может повторять эксперимент неограниченное количество раз, переносить его в желаемые пространственные пределы до тех пор, пока не получит необходимый результат; в) позволяет исследователю по его усмотрению в пределах возможного изменять условия существования предмета, усиливая те из них, исследование которых необходимо; г) дает возможность вмешиваться в естественный ход явлений, ускорять их течение и таким образом приближать время наступления определенных явлений…; д) создает необходимые условия для проявления активности исследователя».

В настоящее время нет, пожалуй, ни одной области медицинской науки, где бы ни применялись те или иные виды экспериментальных исследований. Даже в такой её отрасли, как нормальная анатомия, где научные исследования в течение долгих лет традиционно строились на основе метода натурного наблюдения, эксперимент начинает занимать определенное место. В экспериментальной онкологии наибольшую научную ценность имеют эксперименты на животных.

Эксперименты на животных применяют в тех случаях, когда задачи и приемы экспериментального исследования связаны с возникновением глубоких и стойких нарушений функций организма, влекут за собой заболевание и смерть подопытного животного или обусловлены необходимостью прибегать к приемам вивисекции. Эксперименты на животных являются типичным примером моделирования, широко применяемого в научных исследованиях медико-биологического характера.

При всех видах экспериментальных исследований на животных правильный выбор объекта исследования играет очень важную, нередко решающую роль. Здесь нужно прежде всего иметь в виду, чтобы избранная модель (вид подопытного животного) в наибольшей степени отвечала задачам предпринятого исследования, поскольку реактивность разных видов экспериментальных животных на те или иные внешние раздражители или воздействие инфекционного агента различна. Поэтому, если задача исследования состоит в том, чтобы воссоздать модель того или иного патологического процесса, встречающегося у человека, подбор подопытных животных должен быть исключительно строгим.

Дело в том, что положительные результаты изучения некоторых патологических состояний могут быть получены только при постановке экспериментов на животных определенного вида. Данные, полученные в экспериментах на животных другого вида, будут настолько не соответствовать картине аналогичного патологического процесса, протекающего у человека, что потеряют всякую научную ценность. В тех случаях, когда требуются особо точные и достоверные результаты, опыты проводятся на генетически идентичных особях животных, на так называемых инбрендных линиях («чистые линии»).

Для моделирования онкологических заболеваний и оценки действия испытываемых фармакологических агентов (в том числе и токсикологических исследований) в экспериментальной онкологии наиболее часто опыты проводятся на мелких лабораторных животных – мышах и крысах, но могут быть использованы и кролики, и собаки, и кошки.

Во всех случаях необходимо, чтобы подопытные животные были здоровыми, однопородными (инбрендными), а при постановке серии экспериментов, связанных между собой, - однополыми, примерно одинаковой массы и возраста. При постановке эксперимента в онкологии необходимо учитывать, что перевиваемые опухоли могут расти и развиваться только на определенных линиях животных, из которых они были получены. В противном случае опухоль будет отторгнута иммунной системой хозяина (за исключением использования безтимусных животных, чья иммунная система деактивирована).

Исключительно важное значение для достоверности полученных данных экспериментального исследования имеют условия содержания подопытных животных и уход за ними. Каждому экспериментатору хорошо известны случаи, когда отсутствие должного ухода за подопытными животными сводило на нет результаты очень сложного и трудоемкого эксперимента.

Учитывая большое влияние, оказываемое видом и состоянием лабораторных животных на результаты проводимых на них экспериментов, согласно рекомендациям Международного комитета науки о лабораторных животных, одобренных Всемирной организацией здравоохранения, в научных публикациях, освещающих результаты исследований, выполненных на животных, необходимо сообщать о них следующие сведения: а) источник приобретения животного (название питомника, фирмы, лаборатории или института, откуда получено животное); б) вид, порода или линия животного; в) возраст (масса) и пол животного; г) условия содержания (обычное условие, в барьерной системе, температура и влажность воздуха помещения, тип клеток и количество животных в клетке, освещенность и другие данные); д) характер кормления животных: состав корма (гранулиованный или натуральный корм), стерилизация корма, его количество, периодичность кормления, водообеспечение (через автопоилки или в открытых поилках).

По своему характеру эксперименты на животных могут быть острыми и хроническими. К первой группе относятся эксперименты, в ходе которых проводится однократное выяснение какого-либо вопроса, например экспериментальная проверка нового метода хирургического вмешательства или способа оказания помощи при терминальном состоянии. Нередко планом постановки острого эксперимента предусматривается гибель подопытного животного с последующим патологоанатомическим исследованием его органов и тканей. Хронические эксперименты предполагают длительное, иногда многомесячное наблюдение за подопытными животными, подвергающимися воздействию различных раздражителей. Экспериментальные исследования по изучению противоопухолевого действия новых лекарственных препаратов носят как острый (определение максимально переносимых доз, летальных доз и т.д.) так и хронический характер (оценка выживаемости).

Изучение противоопухолевой активности химиотерапевтических препаратов [4]

Разработка научных основ лекарственного лечения злокачественных новообразований стала возможной в связи с зарождением и успешным развитием экспериментальной онкологии, основоположниками которой мы вправе назвать выдающихся отечественных ученых XIX века М.М. Руднева и М.А. Новинского.

Важное значение для последующего развития экспериментальной онкологии и в том числе экспериментальной химиотерапии опухолей имели исследования М.А. Новинского, осуществившего успешные перевивки опухолей с одного животного на другое. В дальнейшем были получены разнообразные штаммы перевиваемых опухолей, широко используемые в настоящее время в экспериментальной химиотерапии злокачественных новообразований. Трансплантируя опухоль от одного животного на большую группу животных, можно иметь более илии менее однородный экспериментальный материал, позволяющий получать вполне надежные результаты.

Несмотря на известное сходство в происхождении и развитии различных опухолей у человека и животных, надо помнить, что не все закономерности их развития у животных могут быть перенесены непосредственно на человека, а следовательно, и результаты терапевтического воздействия препарата на опухоли животных не всегда могут совпадать с данными клинического применения. Не существует и какой-либо единой методики исследования, позволяющей с большой точностью и в короткий сроквыявить активные в отношении роста злокачественных новообразований препараты.

На современном этапе химиотерапии опухолей, когда уже создано несколько десятков эффективных противоопухолевых препаратов, принадлежащих к разным классам веществ, полная стандартизация и унификация методов отбора новых препаратов должна быть признана не целесообразной. Она может варьировать в зависимости от поставленных задач, от класса исследуемых веществ и тех возможностей, которые имеются у экспериментатора.

В выявлении и изучении противоопухолевой активности препаратов в эксперименте до периода клинических испытаний следует выделить по крайней мере два основных этапа: 1) первичное изучение (первичный отбор) и 2) углубленное и всесторонее изучение (вторичный отбор). Основная задача первого этапа – выявление активного вещества. На втором этапе требуется подтверждение результатов, полученных при первичном изучении, всесторонее и углубленное изучение активного препарата, постановка опытов с целью выявления отличий или преимуществ испытуемого вещества по сравнению с известными противоопухолевыми лекарственными средствами. На основании полученных данных решается вопрос о целесообразности изучения препарата в клинике. Для каждого этапа исследования выбираются соответствующие методы изучения противоопухолевой активности и способы её оценки.

Основным (но не единственным) критерием противоопухолевой активности препарата результат, полученный в терапевтическом опыте на животных с перевивными опухолями. Но было бы неправильно ограничить возможности исследователей, работающих в области поисков лекарственных средств лечения рака, рамками терапевтического опыта на животных. В зависимости от поставленных задач, технических возможностей, количества и качества животных, числа штаммов опухолей и т.д. экспериментатор вправе выбирать любой из известных методов или применить новый,разработанный им самим. Однако при этом следует иметь в виду одно правило: вероятность выявления противоопухолевых свойств вещества, полезных для человека, возрастает при переходе от опытов in vitro к опытам in vivo, от изучения противоопухолевой активности в терапевтическом опыте на одном опухолевом штамме к изучению её на двух и более штаммах, от опытов на перевивных опухолях к опытам на индуцированных и от опытов на индуцированных опухолях к опытам на спонтанных, от опытов на мелких лабораторных животных к более крупным, от применения одного пути введения препарата к двум или нескольким и т.д. Процент же ошибочных заключений о наличии противоопухолевой актвности будет уменьшаться при переходе от одного опыта к двум и более (воспроизводимость резульата), от применения одной дозы (концентрации) препарата к двум и более и т.д.

Все методические приемы, применяемые в настоящее время в экспериментальной химиотерапии опухолей для выявления кацеролитической активности, можно разбить на две категории. К первой относятся методы, в которых используются модели, воспроизводящие в той или иной степени весь патологический процесс. С их помощью можно непосредственно судить о наличии или отсутсвии антибластической активности. В основе этих методов лежит терапевтический опыт на животных со злокачественными образованиями. Вторая категория объединяет методические приемы, при которых используются модели, воспроизводящие лишь часть ракового процесса. Кроме того, к этой же группе можно отнести методы, с помощью которых изучают влияние испытуемого вещества на какой-либо процесс, характерный для злокачественного роста (определение антимитотической активности и т.п.). С помощью тестов второгой категории можно судить об антибластической активности лишь косвенным образом; к ним чаще всего прибегают в тех случаях, когда речь идет о сравнительном изучении ряда веществ, относящихся к одномуи тому же классу химических соединений, в котором уже обнаружены активные противоопухолевые препараты.

Сущность терапевтического опыта сводится к воздействию испытуемыми веществамина злокачественные новообразования лабораторных животных, и по тому, каким образом опухолевая ткань и организм реагируют на это воздействие, судят о терапевтическом эффекте. Этот опыт может дать вполне надежный и достоверный материал для суждения о терапевтической активности исследуемых препаратов.

Для терапевтических опытов рекомендуется использовать перевиваемые опухоли, так как в этом случае имеется возможность, во-первых, подобрать животных, близких по весу и размерам привившихся опухолей, а во-вторых, ввиду быстрого развития последних, закончить опыт в относительно короткий срок (12-16 суток). Однако они удобны лишь для первичной оценки активности препаратов; в дальнейших жеисследованиях необходимо пользоваться как спонтанными, так и индуцированными опухолями.

При изыскании эффективных противоопухолевых средств приходится исследовать большое количество препаратов, характеризующихся разнообразием химических, физико-химических и биологических свойств, использовать для этой цели разные виды лабораторных животных и экспериментальных опухолей, отличающихся по морфологическому строению, происхождению, скорости роста, способности к метастазированию и другим признакам. Из изложенного вытекает, что для выявления противоопухолевых веществ нельзя предложить какой-либо единый стандартный метод или тест. Чувствительность терапевтического опыта и достоверность получаемых при этом результатов могут зависеть от многих условий: количества животных, вида опухоли, начала и продолжительности лечебного воздействия и других факторов.

Построение экспериментальных моделей болезней есть один из вполне законных и сильных методов движения вперед научной мысли в биологии и медицине. Метод моделирования в медицине, имеющий уже в настоящее время значительный удельный вес, будет приобретать все возрастающее значение в будущем.

Медико-этические проблемы экспериментальной медицины

Подсчитано, что ежегодно в мире используется 50—100 миллионов позвоночных животных. Несмотря на исключительную важность беспозвоночных для ряда широкого спектра экспериментов (см. «модельные организмы»), их использование никак не контролируется, а учёт количества не ведется [5]. Большинство животных после применения в опытах усыпляется [6]. Большинство лабораторных животных специально разводят, однако некоторых ловят в дикой среде либо покупают на аукционах и в приютах.

Опыты проводятся в университетах, медицинских училищах, фармацевтических компаниях, фермерских хозяйствах, оборонных предприятиях и коммерческих лабораториях (которые обслуживают нужды промышленности). Опыты относятся к генетике, биологии развития, этологии и прикладным исследования типа биомедицинских, ксенотрансплантации, тестирования лекарств, токсикологических опытов (в том числе тестирование косметики и бытовой химии). Животных используют для обучения студентов и в оборонных исследованиях.

Практически все достижения в медицине XX века каким-либо образом зависели от опытов на животных [7]. Даже мощнейшие компьютеры не способны смоделировать взаимодействие молекул, клеток, органов, тканей, организмов и окружающей среды, что делает опыты на животных необходимыми [8].

Самые ранние упоминания об опытах на животных встречаются в сочинениях древних греков II и I века до н. э. Аристотель (384—322 до н. э.) и Эразистрат (304—258 до н. э.) одними из первых провели опыты на живых животных. Древнеримский врач второго века нашей эры Гален известный, как «отец вивисекции», практиковал вскрытия свиней и коз. Арабский врач Ибн Зухрв XII веке отрабатывал методы хирургии на животных [9,10].

Животных использовали на протяжении всей истории науки. В 1880-м году Луи Пастер доказал микробную природу некоторых болезней, искусственно вызвав сибирскую язву у овцы [11]. В 1890-м И.П. Павлов использовал собак для изучения условных рефлексов. Инсулин впервые выделили из собак в 1922-м году, что произвело революцию в лечении сахарного диабета. 3 ноября 1957 года собака Лайка первая из многих других животных побывала на орбите Земли. В 1970-х с использованием броненосцев были разработаны антибиотики и вакцины против лепры (проказы) [12]. В 1974-м году Рудольф Яниш создал первое генетически модифицированное млекопитающее, интегрировав ДНК из вируса SV40 в геном мыши. Еще один прорыв в генетике был сделан 1996-м году, когда родилась овечка Долли (первое клонированное из соматической клетки млекопитающее).

В XX веке стали обязательны тесты на токсичность лекарств. В XIX веке контроль за лекарствами был менее строгими. Например, в США лекарство могло быть запрещено только после того, как нанесло вред людям. Однако после трагедии «Эликсира сульфаниламида» в 1937 году, когда этот препарат убил более 100 человек, конгресс США потребовал обязательного тестирования лекарств на животных. Другие страны выпустили схожие законы. В 1960-х после «Талидомидовой» трагедии стало обязательным тестирование лекарств на беременных животных.

Споры вокруг опытов на животных восходят к XVII веку. В 1655 году защитник галенической физиологии Эдмунд О’мира [13,14] и другие утверждали, что боль во время экспериментов делает результаты недостоверными, так как физиология животных сильно зависит от боли. Также высказывались возражения с позиции этики — о том, что благо человека не оправдывается вредом животным [14]. Защитники опытов утверждали, что опыты необходимы для прогресса в медицине и биологии. Клод Бернар, известный, как «принц вивисекции» и отец физиологии (его жена Мэри Франсуа Мартин основала первое анти-вивисекционное общество во Франции в 1883 году) писал в 1865-м году: «наука о жизни — это восхитительный и сверкающий зал, попасть в который можно только через большую, грязную кухню»[15].

Разногласия между сторонниками и противниками вивисекции привлекли внимание общественности в 1900-м году, когда произошло уличное столкновение между студентами-медиками и антививисекционистами и полицией у памятника «вивисекционированной» собаке.

В 1822 году Британский парламент принял первый закон в защиту животных. А в 1876 году — первый закон об опытах на животных. Закон поддержал Чарльз Дарвин, который писал Рею Ланкестеру в марте 1871 года: «ты спрашивал о моем отношении к вивисекции. Я совершенно согласен, что она оправдана для исследований по физиологии, но не ради отвратительного и мерзкого любопытства. Эта тема пугает меня до ужаса. И я больше не скажу ни слова, иначе не смогу спать сегодня ночью».

Оппозиция к опытам на животных возникла в США в 1860-х, когда Генри Берг основал «Американское общество по предотвращению жестокости к животным» (ASPCA) и Американское общество против вивисекции (AAVS) в 1883 году. Наибольшего успеха эти организации достигли в 1966-м году, когда в США был принят закон о благополучии животных.

В США каждый год используют 20 миллионов мышей и крыс, а также морских свинок, хомяков, песчанок. Мышей используют чаще остальных из-за их небольшого размера, низкой стоимости, лёгкости содержания и высокой скорости размножения [16]. Они широко применяются для изучения наследственных заболеванийчеловека, так как 99 % генов мышей схожи с человеческими [16]. С развитием технологий генной инженерии генетически модифицированные мыши могут быть созданы на заказ для изучения широкого спектра человеческих заболеваний [16]. Крыс часто используют в психологических исследования, тестах на токсичность и в изучении раковых заболеваний [17].

По данным Департамента сельского хозяйства США, в 2006 году около 670 000 животных (57 %, без учёта крыс, мышей, птиц и беспозвоночных) использовались в опытах, не причиняющих более, чем мгновенную боль. Около 420 000 животных (36 %) — в опытах, вызывающих боль, но с применением обезболивающих. 84 000 животных (7 %) — в опытах, вызывающих боль, но без обезболивающих [19].

В декабре 2001 в Великобритании было выдано 1296 лицензий (39 %) на опыты, вызывающие «лёгкую» боль. 1811 (55 %) — «умеренную» боль. 63 (2 %) — «существенную» боль. 139 животных (4 %) были подвергнуты анестезии и убиты сразу после эксперимента без возвращения в сознание [20]. Кроме того критиковалась сама система подобного учёта [21].

Идея о том, что животные не испытывают боли, относится к концепции французского философа Рене Декарта XVII века. Он утверждал, что животные лишены сознания и не испытывают страданий [18,22]. Философ Бернард Роллин из Государственного университета Колорадо, главный автор двух федеральных законов США, регулирующих вопросы обезболивания в опытах на животных, пишет, что до 1980-х исследователи оставались неуверенны в том, испытывают ли боль животные. Ветеринарам США до 1989 года предписывалось просто игнорировать болевые ощущения подопытного животного [23]. Во время общения с учеными и ветеринарами того времени Роллина часто просили «научно доказать», что животные обладают сознанием и способны чувствовать боль [24]. Сегодня большинство людей убеждены, что животные чувствуют боль[18,24]. Подобная способность у беспозвоночных (например, насекомых) до сих пор остается неясной.

В «Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных» Национальной академии наук США указано, что «способность испытывать боль широко распространена в царстве животных… боль — это стресс-фактор и если не контролируется, может вызывать у животных недопустимые физические страдания». Руководство указывает, что умение распознавать симптомы боли у разных видов чрезвычайно важно для эффективного применения обезболивающих и для эффективности исследований.

Этичность опытов на животных является предметом многочисленных дебатов [25]. Доминирующей точкой зрения сегодня является необходимость опытов ради прогресса в науке при условии, что страдания животных были минимизированы (как и вообще количество лабораторных животных)[26,27].

Противник опытов философ Том Риган считает, что животные являются «субъектами жизни», обладают моральными правами, а их жизнь бесценна. Однако Риган утверждает, что с позиции этики есть разница между убийством людей и животных. Поэтому, по его мнению, ради сохранения жизни людей, допустимо убивать животных. Философ Бернард Роллин утверждает, что люди не обладают правами на животных и поэтому недопустимо использовать последних в собственных целях, не приносящих пользу самим животным. Философ Питер Сингер, основываясь на концепции утилитаризма, не видит обоснования причинению страданий животным ради пользы человека. Правительства Нидерландов и Новой Зеландии запретили использование обезьян в опытах, причиняющих страдания [28]. Ряд медицинских школ Китая, Японии и Южной Кореи воздвигают надгробные памятники (кенотафы) в память об убитых животных. В Японии ежегодно проводят панихиды по убитым в медицинских учреждениях животным.

Некоторые ученые и правительства ряда стран требуют, чтобы страдания, как и само использование лабораторных животных, сводились к минимуму. Существует так называемый «принцип трех Р» (replacement, reduction, refinement — замещение, сокращение, усовершенствование) [29], принятый в большинстве стран:

1. Замещение опытов с животными опытами без использования оных.

2. Сокращение количества животных в экспериментах.

3. Усовершенствование методов исследований, позволяющих минимизировать боль и страдания лабораторных животных, а также улучшить условия их содержания [30].

Так, в апреле 2012 г. Индийское правительство ввело законодательный запрет на использование живых животных в образовательных и исследовательских институтах. Как сообщает газета «Время Индии» [31], Министр окружающей среды и лесов издал приказ, в соответствии с которым колледжи, университеты, исследовательские институты, лечебные учреждения и лаборатории обязаны прекратить использование живых животных для препарирования и вивисекции. Вместо этого они обязаны использовать альтернативы, в том числе компьютерные симуляторы и муляжи, модели и манекены. Одно-единственное исключение для проведения опытов и тестов сделано для молекулярных исследований. Министр окружающей среды и лесов сообщил, что университеты и другие институты «обязаны использовать альтернативы, чтобы избежать причинения животным ненужных страданий и боли». Компьютерные симуляторы и муляжи, по словам Министра, действительно достигают превосходнейших образовательных целей обучения лечению или исследования учеными жизни.

Мандал Джейн, председатель Комитета по Формированию Этики в Отношении Животных (Institutional Animal Ethics Committee (IAEC)) (назначаемый CPCSEA), дал следующие комментарии: Эксперименты на животных должны быть прекращены во всех организациях и институтах, за исключением проводимых молекулярных исследований. В лабораториях постоянно повторяется одна и та же рутинная работа, и жертвы животных становятся абсолютно бессмысленными. Только ученые, проводящие исследования новой молекулярной теории, вправе теперь проводить эксперименты на животных. В медицинских и фармакологических колледжах эта абсолютно ненужная жестокость по отношению к животным должна быть исключена.

Эндрю Роувэн президент HSI (Humane Society International), также прокомментировал эту новость: Решение Индии заменить болезненные, причиняющие вред и часто ненадежные по результатам модели для опытов в виде животных - на здравые подходы к биомедицинским и образовательным исследованиям, не использующие животных, - ЭТО ВАЖНЕЙШИЙ ШАГ В ПРАВИЛЬНОМ НАПРАВЛЕНИИ, и Индия на пути к мировому лидерству в замене опытов над животными гуманными альтернативами. Также Эндрю Роувэн заметил, что в течение всего лишь одного года около 100 миллионов животных «выводятся, инфицируются, инъекцинируются, оперируются без обезболивающих, генетически модифицируются, принудительно приучаются к наркотикам и другим химическим веществам и крайне жестоко убиваются для исследовательских целей, тестирования и образования».

Люди во всем мире требуют от своих правительств последовать примеру Индии и ввести запрет на использование животных в научных экспериментах, заменив такие опыты гуманными альтернативами!

1. НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова: 85 лет на службе здравоохранения. Спб, ООО ИПП «Ладога», 2012 – 352 с., с.:255-268.

2. С.В. Аничков. Ленинская теория отражения и фармакология. Методологические вопросы теоретической медицины. Под ред. Н.П. Бехтеревой, - Л., «Медицина», 1975, 184 с.: 132-139.

3. А.С. Георгиевский. Методология и методика научно-исследовательской работы в медицине. – Изд. 2-е, перераб. и доп. – Л.: Медицина, 1981. – 256 с.: 72-81.

4. Методы экспериментальной химиотерапии. Под ред. Г.Н. Першина, - М., «Медицина», 1971, 540 с.: 357-359.

5. Carbone, Larry. What Animals Want. Oxford University Press, 2004, p. 26.

6. Carbone, Larry. What Animals Want. Oxford University Press, 2004, p. 22.

7. The use of non-human animals in research: a guide for scientists The Royal Society, 2004, page 1

8. «Science, Medicine, and Animals», Institute for Laboratory Animal Research, Published by the National Research Council of the National Academies 2004; page 2

9. Rabie E. Abdel-Halim (2005), «Contributions of Ibn Zuhr (Avenzoar) to the progress of surgery: A study and translations from his book Al-Taisir», Saudi Medical Journal 2005; Vol. 26 (9): 1333—1339.

10. Rabie E. Abdel-Halim (2006), «Contributions of Muhadhdhab Al-Deen Al-Baghdadi to the progress of medicine and urology», Saudi Medical Journal 27 (11): 1631—1641.

11. Mock M, Fouet A (2001). «Anthrax». Annu. Rev. Microbiol. 55: 647–71.

12. Scollard DM, Adams LB, Gillis TP, Krahenbuhl JL, Truman RW, Williams DL (2006). «The continuing challenges of leprosy». Clin. Microbiol. Rev. 19 (2): 338–81.

13. Ryder, Richard D. Animal Revolution: Changing Attitudes Towards Speciesism. Berg Publishers, 2000, p. 54

14. «Animal Experimentation: A Student Guide to Balancing the Issues», Australian and New Zealand Council for the Care of Animals in Research and Teaching (ANZCCART), accessed December 12, 2007, cites original reference in Maehle, A-H. and Tr6hler, U. Animal experimentation from antiquity to the end of the eighteenth century: attitudes and arguments. In N. A. Rupke (ed.) Vivisection in Historical Perspective. Croom Helm, London, 1987, p. 22.

15. In sickness and in health: vivisection’s undoing», The Daily Telegraph, November 2003.

16. Rosenthal N, Brown S. "The mouse ascending: perspectives for human-disease models, " Nat. Cell Biol, Volume 9, issue 9, pp. 993-9, 2007.

17. Aitman TJ, et al. «Progress and prospects in rat genetics: a community view» Nature Genetics 40, 516—522 (2008) DOI 10.1038/ng.147

18. The Ethics of research involving animals Nuffield Council on Bioethics, accessed February 27, 2008.

19. 2005 Report on Enforcement of the Animal Welfare Act U.S. Department of Agriculture, accessed February 8, 2008

20. Ryder, Richard D. "Speciesism in the laboratory, " in Singer, Peter. In Defense of Animals: The Second Wave. Blackwell, 2006. p. 99.

21. Townsend, Mark. «Exposed: secrets of the animal organ lab», The Observer, April 20, 2003. The Home Office response to these allegations is Imutran Ltd: Response to the Home Affairs Committee — licensing and regulating the xenotransplantation research, 14 October 2003

22. Carbone, Larry. ""What Animal Want: Expertise and Advocacy in Laboratory Animal Welfare Policy. Oxford University Press, 2004, p. 149.

23. Rollin, Bernard. The Unheeded Cry: Animal Consciousness, Animal Pain, and Science. New York: Oxford University Press, 1989, pp. xii, 117—118, cited in Carbone 2004, p. 150.

24. Griffin DR, Speck GB (2004) «New evidence of animal consciousness» Anim. Cogn. volume 7 issue 1 pages=5-18

25. Bernard E. Rollin. "The Regulation of Animal Research and the Emergence of Animal Ethics: A Conceptual History, " Theoretical Medicine and Bioethics, Volume 27, Number 4, 2006, pp. 285—304

26. Amendment to Animal Welfare Act, accessed February 27, 2008.

27. Summary of House of Lords Select Committee on Animals In Scientific Procedures, accessed February 27, 2008.

28. Gagneux P, Moore JJ, Varki A. "The ethics of research on great apes, " Nature, volume 437, issue 7055, 2005, pp. 27—29. also see Vermij, P. "Europe’s last research chimps to retire, " Natural Medicine, volume 9, issue 8, 2003, p. 981

29. Flecknell P (2002). «Replacement, reduction and refinement». ALTEX 19 (2): 73–8

30. The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research, accessed December 12, 2007

31.http://articles.timesofindia.indiatimes.com/2012-04-17/india/31355109_1_cpcsea-control-and-supervision-cruelty