Текст:

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия»

Факультет «Промышленной технологии лекарств»

Кафедра «Биохимии»

РЕФЕРАТ

по дисциплине «Клеточная и генная инженерия»

на тему: «Достижения генной инженерии и проблемы биобезопасности трансгенных организмов».

Санкт-Петербург

2015

Оглавление

1. Достижения применения генной инженерии. 4

1.2. Генные вакцины.. 6

1.2.1. Актуальность разработки новых вакцин. 6

1.2.2. Разработка ДНК – вакцин. 7

1.3. Генотерапия. 9

1.4. Перспективы клонирования животных. 11

2. Биобезопасность генно-инженерной деятельности. 14

2.1 Природа рисков для здоровья человека и окружающей среды связанных с ГМО 14

2.2 Возможные неблагоприятные эффекты ГМО на здоровье человека. 16

2.3 Неблагоприятные последствия высвобождения ГМО в окружающую среду 20

Вывод. 23

Список использованных источников. 24

Введение

В своей работе я раскрываю тему достижений генной инженерии и проблем биобезопасности трансгенных организмов. Возможности, открываемые генетической инженерией перед человечеством как в области фундаментальной науки, так и во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны. Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает технологические процессы для получения продуктов ферментации — энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека. Таким образом, генная инженерия, будучи одним из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.

Но особенно большие возможности генная инженерияоткрывает перед медициной и фармацевтикой, поскольку применениегенной инженерии и гибридомных методов может привести к коренным преобразованиям медицины. Многие болезни, для которых в настоящее время не существует адекватных методов диагностики и лечения (раковые, сердечно-сосудистые, вирусные и паразитные инфекции, нервные и умственные расстройства), с помощью генной инженерии и биотехнологии станут доступны и диагностике, и лечению. Под влиянием биотехнологии медицина может превратиться из преимущественно эмпирической в фундаментально теоретически обоснованную дисциплину с ясным пониманием происходящих в организме молекулярных и генетических процессов.

1. Достижения применения генной инженерии

1.1. Создание трансгенных растений

Еще 15 лет тому назад биотехнология растений заметно отставала в своем развитии, но за последние 4 года наблюдается быстрый выброс на рынок трансгенных растений с новыми полезными признаками. Трансгенные растения в США в 1996 году занимали площадь 3 млн. акров, в 1997 году площадь увеличилась до 15 млн. акров, в 1998 году – до 60 млн. акров, а в прошлом году до 80 млн. акров. Поскольку основные трансгенные формы кукурузы, сои, хлопчатника с устойчивостью к гербицидам и насекомым хорошо себя зарекомендовали, есть все основания ожидать, что площадь под генноиженерные растения будет увеличиваться.

В апреле 1998 года доля в процентах трансгенных форм растений в сельском хозяйстве составило:

- кукуруза – 6

- соя – 12

- хлопчатник – 15

- томаты – <1

Так как число жителей за последнее столетие увеличилось с 1.5 до 5.5 млрд. человек, а к 2020 году предполагается вырост до 8 млрд., таким образом возникает огромная проблема, стоящая перед человечеством. Эта проблема заключается в огромном увеличение производства продуктов питания, несмотря на то, что за последние 40 лет производство увеличилось в 2.5 раза, все равно этого не достаточно. И в мире в связи с этим наблюдается социальный застой, который становится все более настоятельным. Другая проблема возникла с медицинским лечением. Несмотря на огромные достижение современной медицины, производимые сегодня лекарственные препараты столь дороги, что ¾ населения земли сейчас полностью полагаются на традиционные донаучные методы лечения, прежде всего на неочищенные препараты растительного происхождения.

В развитых странах лекарственные средства на 25% состоят из природных веществ, выделенных из растений. Открытия последних лет (противоопухолевые препараты: таксол, подофиллотоксин) свидетельствуют о том, что растения еще долго будут оставаться источником полезных биологически-активных веществ (БТА), и что способности растительной клетки к синтезу сложных БТА все еще значительно превосходят синтетические способности инженера-химика. Вот почему ученые взялись за проблему создания трансгенных растений.

Отсчёт истории генетической инженерии растений принято вести с 1982 года, когда впервые были получены генетически трансформированные растения. Метод трансформации основывается на природной способности бактерий Agrobacteriumtumefaciens генетически модифицировать растения. Реконструированные штаммы Agrobactrium, содержащие неонкогенные варианты Ti-плазмид и обладающие повышенной вирулентностью, стали основой одного из наболее популярных методов трансформации. Первоначально трансформация применялась для генно-инженерных двудольных растений, однако работы последних лет свидетельствуют, что этот метод эффективен и в отношении кукурузы, риса, пшеницы. Другим широко распространённым методом трансформации, является технология, основанная на обстреле ткани микрочастицами золота (или других тяжелых металлов), покрытыми раствором ДНК. Все выращиваемые ныне коммерческие сорта получены с помощью названных выше двух методов.

Современный арсенал методов трансформации, однако, довольно обширен и включает такие подходы, как введение ДНК в голые клетки (протопласты), электропорация клеток, микроинъекций ДНК в клетки, прокалывание клеток путём встряхивания их в суспензии микроигл, опосредованная вирусами инфекции и так далее.

Генетические изменённые растения с устойчивостью к различным классам гербицидов в настоящее время являются наиболее успешным биотехнологическим продуктом. Дело в том, что биотехнология позволила совершить такой прыжок, так как оказалось возможным генетически изменять устойчивость растений к тем или иным гербицидам либо путем введения генов, кодирующих белки, нечувствительные к данному классу гербицидов, либо за счет введения генов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов растений. К настоящему времени клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию гербицидов ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения, устойчивые к таким гербицидам, как глифостат и хлорсульфуроновым, и имидазолиноновым гербицидом. Изолированы также гены, которые кодируют ферменты деградации некоторых гербицидов, что позволило получить трансгенные растения устойчивые к фосфинотрицину и далапону. В 1997 году устойчивая к Roundup соя, распространяемая компанией "AsGrow", была признана в США сельскохозяйственным продуктом года.

Ученые пошли далее. Так как множество растений подвержены нападению и поеданию со стороны насекомых, то ученые генной инженерии провели эксперимент с давно известной бактерией Bacillus-Thiringiensis, которая продуцирует белок, оказалось она является очень токсичной для многих видов насекомых, но в то же время безопасна для млекопитающих., белок (дельта-эндотаксин, CRY-белок) продуцируется различными штамами Bacillus-Thiringiensis. Это прототаксин который расщепляется в кишечнике насекомых, образуя активированный токсин. Активизированный белок специфично связывается с рецепторами средней кешки насекомых, что приводит к образованию пор и лизису клеток кишечного эпителия. Взаимодействие токсинов с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое. В природе найдено большое количество штаммов Bacillus-Thiringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты Bacillus-Thiringiensis в течение десятилетий использовались для контроля насекомых на полях.

Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не поедаемые насекомые. Но этот метод потребовал большой работы со стороны генной инженерии, в плане подборов необходимых штаммов и созданию генно-инженерных конструкций, которые дают наибольший эффект для конкретных классов насекомых. Кроме видоспецифичности по действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно больше адениновых и тиминовых нуклеатидных оснований, чем растительная ДНК. Эта проблдема была решена путем создания модефицированных генов, где один из природного гена вырезали и добавили те или иные фрагменты с сохранением доменов, кодирующих активные части дельта-токсинов. Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку. В настоящее время так называемый Bt – растения хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США.

1.2. Генные вакцины

1.2.1. Актуальность разработки новых вакцин

Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или опасных инфекционных заболеваний. По данным созданной в прошлом году международной организации «Всемирный союз по вакцинам и иммунизации» (в числе ее участников — ВОЗ, ЮНИСЕФ, Международная федерация ассоциаций производителей фармацевтической продукции, Программа Билла и Мелинды Гейтс по вакцинации детей, Рокфеллеровский фонд и др.), в настоящее время отсутствуют эффективные вакцины, способные предупредить развитие СПИДа, туберкулеза и малярии, от которых в 1998 г. умерло около 5 млн человек. Кроме того, увеличилась заболеваемость, обусловленная теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. Этому способствовало появление лекарственно-устойчивых форм микроорганизмов, увеличение числа ВИЧ-инфицированных пациентов с иммунной недостаточностью, ослабление систем здравоохранения в странах с переходной экономикой, увеличение миграции населения, региональные конфликты и др. При этом распространение микроорганизмов, устойчивых к воздействию антибактериальных препаратов, приобрело характер экологической катастрофы и поставило под угрозу эффективность лечения многих тяжелых заболеваний. Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, пептическая язва желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированная с H. pylori, злокачественные новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10–15 лет правительства многих стран стали принимать меры, направленные на интенсивную разработку и производство принципиально новых вакцин. Например, в США в 1986 г. был принят закон («National Vaccine Injury Compensation Act»), защищающий производителей вакцин от юридической ответственности при подаче судебных исков, связанных с развитием побочных реакций при вакцинации, если они не были обусловлены ошибками при производстве вакцины. С изменением ситуации увеличился и мировой рынок вакцин, объем продаж которого в 1998 г. составил 4 млрд долларов США в стоимостном выражении. Однако многие считают, что в ближайшие годы этот сектор фармацевтической промышленности будет развиваться гораздо быстрее. Так, согласно публикациям в американском журнале «Signals Magazine» (январь 1999 г.), который освещает ситуацию в современной биотехнологической промышленности, объем продаж вакцин на мировом рынке через 10 лет составит 20 млрд долларов США. Этот прогноз принадлежит М. Греко, исполнительному директору компании «Merieux MSD», совместного предприятия крупнейших производителей вакцин — компаний «Pasteur Merieux Connaught» (теперь «Aventis Pasteur») и «Merck & Co.».

1.2.2. Разработка ДНК – вакцин

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:

• живые аттенуированные вакцины;

• инактивированные вакцины;

• вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или полисахариды);
• рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии.

Технологию рекомбинантной ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленных мутаций генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуногенные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

В 1990 г. в некоторых исследовательских лабораториях приступили к разработке новых вакцин, которые основаны на введении «голой» молекулы ДНК. Уже в 1992–1993 гг. несколько независимых групп исследователей в результате эксперимента доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного способствует формированию иммунитета.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют еще генными, генетическими, полинуклеотидными вакцинами, вакцинами из нуклеиновых кислот. На совещании специалистов по генным вакцинам, проведенном в 1994 г. под эгидой ВОЗ, было решено отдать предпочтение термину «вакцины из нуклеиновых кислот» с их подразделением соответственно на ДНК- и РНК-вакцины. Такое решение основывалось на том, что употребление термина «ДНК-вакцина» не сформирует ошибочное мнение о том, что новые вакцины вносят изменения в генетические структуры организма вакцинируемого человека. Тем не менее, многие специалисты считают более точным термин «генные вакцины» (поскольку иммунная реакция направлена не против ДНК, а против антигенного белка, кодируемого геном), который также часто применяют.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой двухцепочечной ДНК, которая способна к репликации (воспроизведению) в бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины можно вводить в солевом растворе обычным парентеральным способом (внутримышечно, внутрикожно). При этом бoльшая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки. Применяют и другой метод введения, используя так называемый генный пистолет (рис. 5, 6). Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1–2 мкм), затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток. Следует отметить, что аналогичный принцип введения лекарства с помощью струи сжатого гелия используют и для разработки новых способов доставки лекарственных средств (с этой целью оптимизируют размеры частиц лекарственного вещества и их плотность для достижения необходимой глубины проникновения в соответствующую ткань организма). Этот метод требует очень небольшого количества ДНК для иммунизации. Если при иммунизации классическими субъединичными вакцинами вводят микрограммы протеина, то при использовании ДНК-вакцины — нанограммы и даже меньше. Говоря о минимальном количестве ДНК, достаточном для индукции иммунного ответа, С.А. Джонстон, директор Центра биомедицинских изобретений Техасского университета, в журнале «The Scientist» (1998) отмечает, что с помощью генного пистолета можно однократно ввести мыши «фактически 27 тыс. различных плазмид и получить иммунный ответ на индивидуальную плазмиду».

1.3. Генотерапия

Технологии генодиагностики и генотерапии базируются на мировых достижениях в расшифровке генома человека. Технологии генодиагностики включают разработку приемов точной локализации генов в геноме человека, ответственных за наследственные и соматические заболевания, а также методологии пренатальной и доклинической диагностики. Их важной составляющей является сравнительный анализ структуры генома в норме и патологии.

Среди технологий генотерапии в настоящее время актуальны следующие: генотерапия соматических клеток, генотерапия репродуктивных (половых) клеток, генотерапия с использованием рибозимов и антисенс-ДНК.

Генотерапия и генодиагностика - это перспективные технологии фундаментальной и прикладной биомедицины, направленные на лечение и профилактику наследственных (генетических) и приобретенных заболеваний, в том числе онкологических.

В основе генотерапии, развивающейся на базе и в комплексе с генодиагностикой, лежит контролируемое изменение генетического материала клеток, приводящее к "исправлению" не только наследственных, но и, как стало ясно в последнее время, приобретенных генетических дефектов живого организма.

Важнейшей технологической задачей генотерапии является разработка системы переноса или адресной доставки корректирующего генетического материала к клеткам-мишеням в организме больного, несущего в своем геноме дефектный ген. Предлагаемые технологии характеризуются точностью выявления гена, ответственного за генетический дефект и выбора системы переноса корректирующих генов, адресностью доставки в организм больного генетического материала, исправляющего генетический дефект.

Технологии генодиагностики и генотерапии применяются в следующих отраслях:

здравоохранение (развитие методологии генодиагностики и, в частности, системы пренатальной генодиагностики, будет способствовать своевременному выявлению генетических болезней и принятию соответствующих профилактических мер; генотерапия может быть использована для лечения болезней, связанных с мутациями генома (в том числе серповидно-клеточной анемии, эмфиземы, гемофилии и др.), инфекционных заболеваний; для коррекции дефектов центральной нервной системы и для стимуляции иммунного ответа организма при онкозаболеваниях);

сельское хозяйство (технологии генодиагностики и генотерапии могут быть применены в ветеринарии и фитопатологии).

Технологии генодиагностики и генотерапии являются инструментом реализации новой медико-биологической стратегии, конечная цель которой - избавление человечества от генетических и приобретенных болезней. Актуальность генотерапии для человека связана с тем, что более 5000 наследственных и приобретенных заболеваний связано с генетическими дефектами. Генотерапия может использоваться не только для лечения, но и для профилактики наследственных и приобретенных заболеваний. Таким образом, данная технология имеет большое социальное и народнохозяйственное значение.

За рубежом генодиагностика и генотерапия рассматриваются как один из приоритетов развития биомедицины. К настоящему времени одобрено более 7 протоколов по генотерапии, в которых предложены способы лечения наследственных заболеваний. Такие протоколы разрабатываются в Китае, Франции, Великобритании, Италии, Нидерландах и ряде других стран. В США Национальным Комитетом по рекомбинантным ДНК (RAC) одобрено 18 клинических испытаний с использованием генотерапии, начато лечение одного из видов рака кожи - меланомы.
В Российской Федерации также освоены основные технологии генотерапии - секвенирование, физическое и генетическое картирование генома человека и животных, осуществляется расшифровка молекулярных механизмов наследственных и онкозаболеваний, решаются проблемы генетической безопасности человека, сохранения его генофонда в условиях разрушающего антропогенного воздействия среды. Вместе с тем, для достижения зарубежного уровня в этой области России необходимо принять срочные меры по увеличению финансирования НИОКР и по усилению приборного обеспечения. Необходимым условием развития предлагаемых технологий в стране является организация международной кооперации.

Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и наследственных (инфекционных) заболеваний. Путем введения в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генетической терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухаль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генетической терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезоминазы (АДА). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) 4-летней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1:100000), были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные в не организма (exvivo) геном АДА (ген АДА + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдается в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 месяцев. За 3 года терапии проведены 23 внутривенные инъекции. В результате лечения, состояния пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Сейчас эти испытания проводятся в Италии, Франции, Великобритании и Японии.

1.4. Перспективы клонирования животных.

Идея клонирования животных, т.е. получение генетически идентичных копий, родилась благодаря успешным экспериментам по пересадке ядер дифференцированных клеток в энуклеированные яйцеклетки или ооциты, выполненным на амфибиях. Цель этих экспериментов была сугубо теоретическая - выяснить вопрос, способно ли ядро (геном) дифференцированной клетки к репрограммированию и восстановлению тотипотентности, т.е., будучи помещенным в цитоплазму яйца, способно ли оно обеспечить полное развитие подобно оплодотворенной яйцеклетке. Фактически речь шла о возможности обратимости эмбриональной дифференцировки и выяснению вопроса: претерпевает ли геном в процессе развития необратимые изменения или модификации? Успешные опыты J.Gurdon и его сотрудников, показавшие возможность развития взрослых амфибий из реконструированных яйцеклеток после трансплантации в них ядер из клеток эпителия кишечника плавающей личинки (головастика), были интерпретированы как убедительное доказательство, что геном дифференцированных клеток способен к репрограммированию в цитоплазме яйцеклетки и восстановлению тотипотентности, подобно оплодотворенному яйцу. Из этих результатов логично вытекало, что используя технику трансплантации ядер из соматических клеток взрослых особей в энуклеированные яйца или ооциты, можно получать генетические копии животного, служившего донором ядер дифференцированных клеток. Безусловно, клонирование животных открывало бы заманчивые перспективы для генетического копирования животных, прежде всего сельскохозяйственных, тех, которые имеют те или иные выдающиеся показатели продуктивности.

Однако первые попытки применить описанный выше подход для клонирования млекопитающих были безуспешными и даже скандальными. Сенсационные результаты Illmensee по рождению мышей, развившихся после пересадки кариопластов из разных частей предимплантационных эмбрионов мыши в энуклеированные яйца, не были подтверждены другими исследователями. Эти результаты вызвали еще большие сомнения после заявления лаборанта Illmensee, что результаты опытов Illmensee были фальсифицированы. В начале 80-х годов эксперименты по трансплантации ядер дифференцированных клеток в энуклеированные яйца или ооциты показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 2-го деления-дробления. Другой экспериментальный подход для изучения тотипотентности эмбрионов был основан на разделении бластомеров на ранних стадиях развития (до 16-клеточной стадии) и независимой их трансплантации приемным матерям. Результаты этих экспериментов показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 4-клеточ-ной стадии, хотя у овец такая потеря происходит на более поздней стадии развития (после 16-клеточной стадии). Открытие импринтинга и его существенной роли в развитии млекопитающих сделало еще более проблематичной возможность клонирования млекопитающих, поскольку выяснилось, что материнский и отцовский геномы имеют разный вклад в нормальное развитие эмбриона, причем эти функциональные различия родительских геномов формируются в процессе овогенеза и сперматогенеза, импринтируются и реализуются в течение всего онтогенеза.

Тем не менее, исследования тотипотентности и плюрипотентности в эмбриональном развитии продолжались с использованием новых экспериментальных подходов. Уже в конце 80-х годов стало очевидным, что ооцит на стадии М2 (второе меойтическое деление) обладает факторами, способными репрограммировать геном клеток, полученных из внутренней клеточной массы бластоцисты после их трансплантации в энуклеированный ооцит М2. Здесь следует отметить значительный вклад в разработку этой техники шотландской группы исследователей под руководством Ian Wilmut и американских исследователей Keefer, Mathews и First. В 1996 г. вышли две публикации по успешному рождению ягнят и развитию эмбрионов коров до 80-85 дней беременности в экспериментах по трансплантации кариопластов, полученных из клеток культуры эмбриональных стволовых клеток, в энуклеированные ооциты М2 (Campbell et al., 1996; Keefer et al., 1996). По-видимому, эти успехи подтолкнули Ian Wilmut и его коллег попытаться использовать в качестве доноров ядра (кариопласты) дифференцированных клеток, взятых от эмбрионов или взрослых животных. Результатом этих экспериментов явилось рождение Dolly, овцы, развившейся из ооцита М2, у которого было заменено собственное ядро на ядро клетки из культуры эпителиальных клеток, полученной из молочной железы взрослой лактирующей овцы. Вне всяких сомнений, это выдаюшийся успех в клонировании животных. Впервые предложен, хотя и сложный в техническом отношении, способ получения генетических копий млекопитающих. Несомненно также и то, что клонирование станет сильнейшим стимулом для развития нового направления в биотехнологии животных и откроет широкие возможности в селекции сельскохозяйственных животных.

В теоретическом плане работа группы Ian Wilmut показала, что в процессе развития геном не претерпевает каких-либо необратимых изменений, по крайней мере, в части высокодифференцированных соматических клеток. Более того, возможно репрограммирование генома соматических клеток путем трансплантации его в цитоплазму ооцита М2. Фактически это исследование заложило теоретическую базу клонирования животных, хотя здесь имеется много неясностей и нужны дополнительные экспериментальные исследования.

Уместно в этом контексте упомянуть недавние результаты, полученные в лаборатории генетических основ онтогенеза Института цитологии и генетики СО РАН. Здесь были впервые получены гибридные клетки путем слияния высокоплюрипотентных стволовых эмбриональных клеток с клетками селезенки взрослой мыши. Некоторые клоны гибридных клеток имели нормальный диплоидный набор хромосом и дополнительную Х-хромосому, происходящую из высокодифференцированной клетки. В экспериментах по микроинъекциям гибридных клеток в полость бластоцисты была получена серия химерных животных, что показало сохранение высокой плюрипотентности в гибридных клетках. Однако самым впечатляющим результатом этих опытов было обнаружение функциональной "соматической" Х-хромосомы (происходящей от дифференцированной клетки) в разных тканях и органах химер. Показана возможность репрограммирования индивидуальной хромосомы, происходящей от дифференцированной клетки, при введении ее в геном плюрипотентных эмбриональных клеток. Иными словами, получены сходные данные по обратимости дифференцировки на уровне индивидуальных хромосом генома дифференцированной клетки, подобно реактивации целого генома в опытах Ian Wilmut. Другим следствием этого исследования является возможность переноса индивидуальных хромосом от одного животного в геном другого этого же или близкого вида. Таким образом, открывается перспектива использовать плюрипотентные гибридные клетки в качестве носителей-векторов для переноса индивидуальных хромосом между животными и создавать уникальные генотипы, не существующие в природе, поскольку их невозможно получить обычным половым путем.

2. Биобезопасность генно-инженерной деятельности

2.1 Природа рисков для здоровья человека и окружающей среды связанных с ГМО

Любой трансгенный сорт растения отличается от исходного только тем, что в его генетическом материале к 25 - 30 тысячам существующих генов добавлен относительно небольшой фрагмент ДНК, в котором записана информация об одном-двух новых генах и их регуляторных элементах.

Активность этих добавленных генов в организме выражается в биосинтезе одного-двух новых для организма протеинов (ферментов или структурных белков). Поскольку генетическая инженерия может оперировать любыми генами, существующими в природе, а не только генами от организмов, состоящих в эволюционном родстве с отдельными видами культурных растений, как это делается в традиционной селекции, то продукты привнесенных генов (ферменты, протеины) могут выглядеть в генетически модифицированном организме как необычные, несвойственные, чужеродные для данного вида, которые в природе у него не встречаются.

Что касается рекомбинантных протеинов, то не во всех ГМО они являются абсолютно чужеродными, несвойственными для определенного вида соединениями.

Во-первых, существует достаточно большая группа трансгенных сортов растений, которые получены благодаря генетическим манипуляциям с их собственными генами (томаты с удлиненным периодом хранения, соя, рапс с улучшенным составом масла, картофель с улучшенным качеством крахмала, кофе без кофеина, табак без никотина и другие).

Во-вторых, многие весьма отдаленные в эволюционном плане организмы имеют большое количество идентичных путей метаболизма, и соответственно состав и строение ферментов, которые обеспечивают их реализацию, также идентичны. В качестве примера можно привести фермент EPSPS, который является ключевым в биосинтезе ароматических аминокислот у всех растений, грибов, бактерий. Бактериальный EPSPS, образующийся у трансгенной сои, толерантной к гербициду Раундап, вполне успешно выполняет соответствующие функции в растительном организме после обработки растений гербицидом, когда свой, растительный EPSPS сои дезактивирован.

Однако при оценке безопасности таких близких по функциональной активности генов следует обращать внимание не столько на сам белок - продукт трансгена, сколько на возможное изменение отдельных путей метаболизма трансгенного растения из-за повышения концентрации одного из их компонентов. В случае с тем же EPSPS при оценке безопасности генетически модифицированной сои принималось во внимание, что этот фермент катализирует реакцию, не лимитирующую конечную скорость синтеза ароматических аминокислот, поэтому, как и ожидалось, показатели их синтеза у ГМО не отличались от таковых у исходных растений.

В-третьих, последние научные данные, полученные в результате изучения строения генетического материала человека, некоторых животных и растений, существенно расширили наши представления о сходстве и отличиях генов разных систематических групп и вероятности их переноса от одной отдаленной систематической группы к другой (горизонтальный перенос генов).

Оказалось, что в геноме растения арабидопсис присутствует около сотни генов человека, в том числе таких, как ген рака молочной железы. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens регулярно переносит часть своих генов в растения, вызывая у них образование опухоли - корончатый галл. Это абсолютно естественный процесс, который с успехом используют и генные инженеры. Подобных примеров можно привести очень много.

Таким образом, то, что делают генетики, ни в коей мере не противоречит законам природы. Обмен генетической информацией между отдаленными видами в ней происходит постоянно. В отдельных случаях для этого требуются миллионы лет, а в некоторых это может происходить ежедневно и ежечасно.

Вторая основная группа рисков связана с самим фактом вставки трансгенов в генетический материал организма. Есть основания полагать, что встраивание трансгенов происходит случайным образом, то есть они могут встроиться практически в любую область молекул ДНК, содержащихся в трансформируемой клетке: в любую хромосому, любую часть хромосомы, если речь идет о высших организмах.

Чем это чревато? Прежде всего, тем, что привнесенный ген может затронуть область ДНК, которая кодирует структуру или регуляторные элементы какого-либо гена модифицируемого организма. Вероятность этого события в целом не так велика, как может показаться на первый взгляд. Дело в том, что генетический материал высших организмов устроен таким образом, что собственно генами и их регуляторными элементами занято менее 10% длины молекулы ДНК, что, как полагают, повышает стабильность, устойчивость молекулы ДНК к внешним воздействиям. Это означает, что гены на молекуле ДНК расположены не плотно один за другим, как кадры на кинопленке, а через большие промежутки, занятые некодирующими последовательностями нуклеотидов. Более того, даже в пределах кодирующих последовательностей генов (то есть той области молекулы ДНК, в которой записана информация о последовательности аминокислот в белке - продукте гена) имеются области, так называемые интроны, которые также не несут никакой генетической информации. Они вырезаются в ходе "созревания" молекулы информационной РНК, образовавшейся при транскрипции гена. Тем не менее вероятность того, что трансген может встроиться в область ДНК, уже занятую другим геном, все же существует.

Если при этом будет затронута область, кодирующая структуру поврежденного гена, то в результате продукт данного гена образовываться не будет. Этот ген как бы распадается на две неполноценные части: одна, передняя, имеет элементы, необходимые для начала транскрипции (образования информационной РНК), но не имеет терминальной последовательности, другая, задняя, имеет только терминальные элементы. К тому же обе части кодирующей области являются неполными. Очевидно, что аналогичный результат будет иметь место и в случае повреждения промотора или терминальных последовательностей.

Если затронутый ген выполняет какую-то важную функцию в организме, то отсутствие его продукта может иметь весьма печальные для него последствия, вплоть до потери жизнеспособности. Понятно, что до уровня коммерческого сорта генотипы с поврежденными генами дойти не могут в принципе.

Если в процессе встраивания будут затронуты другие регуляторные элементы - энхансеры ("усилители" активности генов) или сайлэнсеры ("замедлители"), то это может привести к изменению активности затронутых вставкой генов. Сорта растений, образующие какие-либо токсичные соединения (например, соланины картофеля) в концентрациях, безвредных для здоровья человека, в результате генетической модификации способны усилить их синтез до уровня, превышающего предельно допустимые значения. Такие генотипы уже становятся опасными для здоровья.

Наконец, третья основная группа рисков, связанных с генно-инженерными организмами, основана на неблагоприятных эффектах, вызванных переносом трансгенов другим организмам: вертикальным переносом генов от ГМО диким сородичам культурного вида или горизонтальным переносом генов, например селективных генов устойчивости к антибиотикам от генетически модифицированного растения микроорганизмам пищеварительного тракта. Здесь все понятно: гены и их продукты, безобидные у ГМО, могут оказаться весьма опасными в другой генетической и экологической среде. Так, приобретение болезнетворными бактериями пищеварительного тракта устойчивости к антибиотикам может существенно затруднить лечение болезней, которые они способны вызывать. [14,15,16]

2.2 Возможные неблагоприятные эффекты ГМО на здоровье человека

Среди потенциальных рисков для здоровья человека, связанных с использованием генно-инженерных организмов, рассматриваются следующие:

-синтез новых для реципиентного организма белков - продуктов трансгенов, которые могут быть токсичными и/или аллергенными;

-изменение активности отдельных генов живых организмов под влиянием вставки чужеродной ДНК, в результате которого может произойти ухудшение потребительских свойств продуктов питания, получаемых из этих организмов.

-горизонтальная передача трансгенов другим организмам, в частности маркерных генов устойчивости к антибиотикам от ГМО микроорганизмам пищеварительного тракта.

Понятно, что когда говорят о рисках для здоровья человека, связанных с ГМО, имеют в виду прежде всего риски при потреблении продуктов, полученных из них или произведенных ими (например, молока от генетически модифицированных коров). Стратегия оценки безопасности генетически модифицированных продуктов питания основана на принципе "существенной эквивалентности", разработанном OECD (Организацией экономического сотрудничества и развития).

Для идентификации в новых продуктах и исходном сырье отличных от аналогов признаков, влияющих на уровень безопасности и питательную ценность пищевых продуктов, тщательному анализу подвергается информация, касающаяся характеристик исходного организма, от которого взят ген, предназначенный для трансгеноза, а также характера генетической модификации. Далее проводят сравнительный анализ генетически модифицированного организма и исходного (немодифицированного) организма. Для этого сопоставляют агрономические показатели, продукты встроенных генов, состав ключевых химических компонентов (в том числе питательных и антипитательных), профиль основных метаболитов, эффекты переработки исходного сырья.

Новый продукт (сорт растений) может быть:

эквивалентным по существенным признакам выбранному аналогу;

эквивалентным аналогу, за исключением одного (нескольких) существенного, хорошо определяемого признака;

не эквивалентным аналогу по существенным признакам.

Во 2-м и 3-м случаях проводится тщательная оценка безопасности отличных от исходного аналога признаков ГМО по таким показателям, как потенциальная токсичность, потенциальная аллергенность, возможность переноса генов устойчивости к антибиотикам микроорганизмам пищеварительного тракта, вероятность потенциального ухудшения пищевой ценности и усвоения питательных веществ.

Стратегия оценки потенциальной токсичности новых продуктов питания состоит в следующем. Если исследуемое, отличное от аналога, вещество является известным компонентом растительной пищи, имеющим длительную историю безопасного использования, исследования токсичности новых продуктов не являются обязательными.

В иных случаях осуществляются:

определение концентрации потенциальных токсинов в съедобных частях растений; установление удельного веса данного продукта в пищевом рационе определенных групп населения;

сравнение (для белков) их аминокислотной последовательности с таковой у известных токсинов и пищевых антагонистов (например, ингибиторов протеаз) по электронным базам данных;

оценка стабильности новых веществ к термической обработке;

определение скорости разрушения потенциальных токсинов в желудочно-кишечном тракте (в модельных системах);

анализ уровня токсичности новых веществ в модельных системах (культура клеток in vitro);

анализ токсичности в экспериментах по принудительному скармливанию лабораторным или домашним животным пищи, содержащей продукты, полученные из изучаемого генетически модифицированного организма, или ее новых компонентов в течение длительного времени (хронический эксперимент - продолжительность 1 - 2 года) либо в течение короткого времени, но с использованием высоких концентраций изучаемых продуктов (острый эксперимент - продолжительность около двух недель, концентрация изучаемого продукта трансгена до 5 граммов на килограмм веса животного).

Из всего многообразия трансгенных сортов можно выбрать фактически только единицы, у которых в результате генетической модификации образуются действительно новые, не характерные для обычных сортов данного вида соединения. Это ферменты фосфинотрицинацетилтрансфераза и неомицинфосфотрансфераза, которые обеспечивают дезактивацию соответственно гербицида глюфозината аммония (Либерти, Баста) и антибиотиков - аминогликозидов канамицина, неомицина, генетицина. Тем не менее и вещества, имеющие длительную историю безопасного использования, тоже проходят тщательную проверку.

Как видим, большинство белков - продуктов трансгенов относятся к нестойким соединениям: они легко денатурируют даже при относительно невысоких температурах (следовательно, разрушаются при переработке растительного сырья) и кислотности среды.

Все они быстро перевариваются в желудочном соке. Содержание их в растительных тканях очень низкое.

Это означает малую вероятность того, что перечисленные протеины могут вызывать аллергические реакции. Ведь для аллергенов характерны следующие признаки: устойчивость к перевариванию, к переработке, молекулярная масса 10-70 кдальтон, содержание в пище более чем 1%. Для того чтобы развилась аллергическая реакция, белок должен поступать в тонкий кишечник в практически неизмененном состоянии (там происходит его всасывание в кровь с последующим образованием антител).

Естественно, на практике обычно получают большое количество трансгенных форм, из которых в ходе последующей традиционной селекции отбирают образцы без видимых мутаций. Затем тщательнейшим образом изучают безопасность отобранных форм для здоровья человека и окружающей среды. В частности, анализируют содержание в растительном сырье как питательных так и потенциально опасных для здоровья веществ.

Так, результаты 1400 аналитических экспериментов, проведенных при изучении вышеупомянутой RR-сои (устойчивой к Раундаупу), подтвердили полную идентичность трансгенного и исходного сортов сои как по питательным, так и антипитательным свойствам.

В качестве первых фигурировали: содержание белка, жира, волокон, зольных элементов, углеводов, калорийность, влажность зерна, "питательные" свойства переработанного зерна - сухой муки, обезжиренной муки, белкового изолята, концентрата, лецитина, очищенного масла, дезодорированного масла и т.п. Не выявлено различий по специфическим жирным кислотам, аминокислотам, в частности ароматическим аминокислотам. Естественно, особое внимание было уделено "антипитательным" компонентам соевого зерна: ингибитору трипсина, лектинам, фитоэстрогенам, стахиозе и фитату. По содержанию этих веществ генетически модифицированный организм и исходная линия также не различались. Анализ "существенной эквивалентности" ГМО и исходной линии наиболее актуален для видов растений, которые в принципе могут быть опасными для здоровья человека: картофель, томаты (из-за токсичных гликоалкалоидов), хлопок (из-за токсичного госсипола) и некоторые другие.

Следующим фактором, который рассматривается в качестве потенциального неблагоприятного эффекта генетически модифицированных организмов на здоровье человека, является горизонтальный перенос трансгенов (прежде всего генов устойчивости к антибиотикам) от ГМО микрофлоре пищеварительного тракта человека и животных.

В состав любой трансгенной конструкции, как правило, входит помимо собственно трансгена и его регуляторных элементов и так называемый селективный (или маркерный) ген, необходимый для отбора трансформированных клеток. В качестве селективных генов обычно используют гены устойчивости к антибиотикам, которые уже утратили свое значение как антимикробные препараты из-за широко распространенной устойчивости микроорганизмов к этим антибиотикам.

Кроме того, вероятность переноса селективных генов из ДНК продуктов питания, полученных из генетически модифицированных организмов, к микроорганизмам пищеварительного тракта крайне низкая (она оценивается как приблизительно 10~17). Для этого требуется несколько крайне маловероятных событий: участок ДНК, содержащий селективный ген, не должен быть поврежден в процессе пищеварения, необходима гомология селективного гена или прилегающих к нему районов ДНК с ДНК хромосомы или плазмиды болезнетворной бактерии пищеварительного тракта, а для того, чтобы селективный ген экспрессировался в ней после переноса, он должен встроиться под подходящим прокариотическим промотором.

Если умножить вероятность горизонтального переноса селективного гена на возможные последствия такого переноса (появление одной новой бактерии с устойчивостью к антибиотику в придачу к тысячам уже существующих с такой же устойчивостью), то серьезно обсуждать подобные риски можно, пожалуй, только перед непросвещенной публикой в пропагандистских целях. Еще более несерьезным выглядит рассмотрение последствий переноса трансгенов или селективных генов в ДНК клеток человека: продолжительность жизни клеток эпителия пищеварительного тракта около 7 дней, никакого контакта пищи с половыми клетками человека не может быть в принципе.

Следовательно, наличие в трансгенных конструкциях селективных генов антибиотикоустойчивости не является опасным для здоровья человека и окружающей среды, но, учитывая озабоченность, а часто и неприятие общественностью этого факта, ученые прилагают усилия по разработке альтернативных селективных систем.

Так, все чаще в качестве селективных генов используют гены устойчивости к гербицидам (правда, экологи опасаются, что это приведет к росту гербицидоустойчивости сорняков), нетоксичным сахарам (типа ксилозы, маннозы, 2-деоксиглюкозы), гены индуцированной экспрессии фитогормонов и другие. Разработаны методы удаления селективных генов у трансформантов после проведения селективной процедуры или получения безмаркерных трансгенных линий с помощью котрансформации с последующим негативным отбором по селективным генам в беккроссных поколениях. [17,18, 19]

2.3 Неблагоприятные последствия высвобождения ГМО в окружающую среду

В представлении обывателя генетически модифицированные организмы ассоциируются прежде всего с якобы страшной опасностью, угрожающей здоровью населения. По мнению же специалистов, намного более существенными представляются риски для окружающей среды. Ведь первую группу рисков (для здоровья человека) можно оценить достаточно точно, чтобы их предупредить и практически полностью исключить.

В случае же с рисками для окружающей среды ситуация намного сложнее. Необходимо учитывать различные сложные взаимодействия организма и среды, многие из которых с трудом поддаются точной оценке или даже непредсказуемы. Особенно сложно бывает спрогнозировать отдаленные последствия, различные каскадные эффекты: ведь в дикой природе все взаимосвязано. Да и устранить возможные неблагоприятные последствия бывает очень сложно: если ГМО попали в окружающую среду, размножились и, что самое неприятное, передали свою генетическую информацию другим видам, то практически невозможно вернуть все в исходное состояние в случае обнаружения каких-либо неблагоприятных эффектов.

Возможны следующие неблагоприятные эффекты ГМО на окружающую среду:

-разрушительное воздействие на биологические сообщества и утрата ценных биологических ресурсов в результате засорения местных видов генами, перенесенными от генетически модифицированных организмов;

-создание новых паразитов, прежде всего сорняков, и усиление вредоносности уже существующих на основе самих ГМО или в результате переноса трансгенов другим видам;

-выработка веществ - продуктов трансгенов, которые могут быть токсичными для организмов, живущих или питающихся на генетически модифицированных организмах и не являющихся мишенями трансгенных признаков (например, пчел, других полезных или охраняемых видов);

неблагоприятное воздействие на экосистемы токсичных веществ, производных неполного разрушения опасных химикатов, например гербицидов (значительное количество создаваемых в настоящее время ГМО - формы, устойчивые к гербицидам).

Как известно, в природе нет ничего лишнего: существует определенный баланс между отдельными видами в пределах любого биологического сообщества. Живые организмы находятся между собой в тесном контакте и взаимозависимости. Вероятность изменения биологического многообразия без вмешательства человека ничтожна. Увеличение численности популяции какого-либо вида в отдельные промежутки времени, например из-за колебаний климатических факторов, немедленно включает механизм, ограничивающий этот рост, и баланс между видами восстанавливается. Поэтому, говоря о первой группе риска из числа приведенных выше (разрушительное воздействие трансгенов на биологические сообщества), имеют в виду следующее. При переносе отдельных трансгенных признаков, прежде всего имеющих адаптивное значение в окружающей среде (устойчивость к холоду, жаре, засухе, засолению), от культурных сортов к их диким сородичам возможна ситуация, при которой последние могут приобрести дополнительные преимущества в борьбе за существование. А это чревато изменением того самого баланса между видами, существующего в природе. Последствия могут быть печальны: увеличение численности одних видов может сопровождаться снижением численности других и даже их утратой.

Проблема появления суперсорняков и супервредителей также фигурирует среди основных, когда рассматривают экологические риски, связанные с ГМО. Сорняки - это группа растений с определенным набором адаптивных признаков, которые помогают им существовать в окружающей среде, в том числе среди посевов культурных растений, несмотря на жесткую конкуренцию со стороны других организмов, а также постоянное воздействие со стороны человека, который пытается их искоренить.

Применение трансгенных сортов с инсектицидными свойствами (благодаря Bt-гену) сразу же породило вопрос: а не повлияют ли отрицательно эти сорта на биологическое разнообразие, воздействуя на насекомых, которые не являются "мишенью" трансгенного признака? Имеются в виду прежде всего такие полезные насекомые, как пчелы, божьи коровки, златоглазки. К счастью для природы, Bt-протеины отличаются высокой избирательностью своего действия. Тем не менее возможные негативные эффекты, связанные с нецелевым воздействием ГМО на другие организмы, обязательно тщательно взвешиваются при проведении оценки их биобезопасности.

Еще одним фактором риска считают возможное увеличение объемов применения гербицидов. В связи с тем, что первые ГМО обладали в основном признаками толерантности к гербицидам, возникло опасение, что их использование может привести к неблагоприятному воздействию на экосистемы токсичных веществ, производных неполного разрушения опасных химикатов, например гербицидов. Однако практика использования гербицидоустойчивых генетически модифицированных сортов показала противоположную тенденцию. Поскольку эффективность контроля над сорняками с помощью комбинации ГМО и соответствующего гербицида выше, чем в обычной практике применения химикатов, то общий объем гербицидов, внесенных на поля с генетически модифицированными сортами, оказывается ниже обычного.

Вывод

Ситуация, которая сложилась с отношением к использованию ГМО, не является исключением в истории человечества. Так было всегда: любые новые продукты (кофе, томаты, картофель, кукуруза) европейцы вначале встречали, мягко говоря, с недоверием. Научные данные и уже имеющийся немалый опыт использования ГМО свидетельствуют о том, что большинство рисков, которые с ними связывают, являются скорее гипотетическими, чем реальными.

Основной принцип биобезопасности - принцип принятия мер предосторожности. Суть его не в том, что все, без исключения, созданное с помощью генетической инженерии опасно для здоровья человека и окружающей среды, а в том, что мы не можем пока с полной уверенностью говорить о совершенной безопасности любого трансгенного растения.

Нельзя сказать, что продукты, содержащие ГМО, абсолютно безопасны. Когда человек спешит пользоваться не до конца изученными законами, ничего хорошего не получается. А если к тому же подключается человеческие страсти, жадность, агрессия и другие "милые" черты человечества, то случается не маленькая катастрофа.

Из реальных опасностей можно выделить две.

Первая: не контролируемые эксперименты с генетикой могут нарушить биологическое разнообразие и даже изменить до неузнаваемости фауну и флору.

Вторая: недобросовестный исследователь или дилетант создает генную конструкцию с непредсказуемыми побочными эффектами. Учитывая помешанность человечества на прибыли и деньгах, существует большая вероятность того, что новый вид безо всяких испытаний попадет в широкое использование.

Поэтому, человечеству, конечно же, нужно быть аккуратными и основательными, но в тоже время не поддаваться на провокации о генных мутациях, которые не имеют под собой научных оснований.

Список использованных источников

1. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир, 1987

2. Ли А., Тинланд Б. Интеграция т-ДНК в геном растений: прототип и реальность. Физиология растений. 2000, том 47, № 3. с.354-359

3. Б. Глик, Дж. Пастернак. Молекулярная биотехнология - М.: Мир, 2002. с.117 - 139, с.156-167.

4. Н.А. Лемеза Л., В., Камлюк Н.Д. Лисов "Пособие по биологии", с.74-82, с.95-110, с.145-156.

5. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - Москва, 1998, с.13-18, с.54-59, с.78-93.

6. Зверева С.Д., Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования // Физиология растений. 2000. Т.47, № 3. с.479-488.

7. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. - Москва, 1981, с.31-40, с.46-48, с.95-99.

8. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дегтярев и др.: Под ред. В.С. Шевелухи. М.: Высш. школа, 1998. с.359, с.416.

9. Романов Г.А. Генетическая инженерия растении и пути решения проблемы биобезопасности, 2000. Том 47, № 3. с.343-353

10. Ангурец А.В. Классификация рисков при использовании ГМО. "Физиология трансгенных растений и проблемы биобезопасности". с.36-48, с.69, с.84-89.

11. Барановов В.С. Генная терапия - медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал. № 3.1999. с.3 - 68.

12. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н. и др. Генетика развития растений. СПб.: Наука, 200.539 с.

13. Кузнецов В.В. Возможные биологические риски при использовании генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. "Вестник ДВО РАН" № 3, 2005, с.40