Возбудитель сибирской язвы

Реферат по микробиологии на тему:

«Возбудитель сибирской язвы»

Москва 2015 г.

Содержание

1. Морфология, тинкториальные и другие свойства…………………...……….3

2. Отбор пат. материала…………………………………………………………..5

3. Консервирование…………………………………………………………..…..6

4. Факторы патогенности………………………………………………..………7

5. Биопрепараты………………………………………………………………….8

6. Пункты плана диагностики…………………………………..………………9

Список используемой литературы……………………………………………..16

1. Морфология, тинкториальные и другие свойства

Возбудитель сибирской язвы (В. anthracis) представляет собой крупную палочку с обрубленными концами (в среднем 1,5X8 мкм). В окрашенном препарате палочки располагаются одиночно, попарно или цепочкой.

Грамположительны. Микроб неподвижен, окружен прозрачной капсулой, образование которой характерно для вирулентных штаммов. Капсула образуется как в организме больных людей и животных, так и при культивировании на специальных питательных средах. В неблагоприятных условиях внешней среды при доступе кислорода и температуре от 15 до 42°С микроб образует спору, которая располагается центрально и имеет овальную форму. Диаметр ее не превышает поперечника клетки. При попадании в благоприятную среду споры прорастают в течение нескольких часов.

Возбудитель сибирской язвы относится к факультативным аэробам. Оптимальная температура роста 35— 37°С и рН 7,4—8,0. Микроб нетребователен к питательным средам, поэтому может расти даже на таких субстратах, как настой соломы, сырой и вареный картофель, экстракты злаков, гороха и др. На мясо-пептонном агаре рост настолько характерен, что имеет диагностическое значение. Через 24 ч роста появляются колонии: серебристо-серые, зернистые, диаметром 3—5 мм, с бахромчатыми краями и отходящими от них пучками нитей, напоминающими голову медузы или львиную гриву. Такой рост (R-форма) характерен для вирулентных штаммов.

В старых культурах появляются гладкие S-формы колоний, авирулентные. В бульоне через 18—24 ч образуется осадок в виде хлопьев, а сам бульон остается прозрачным.

Биохимическая активность невелика: разлагает глюкозу, мальтозу, сахарозу с образованием кислоты, молоко медленно свертывает и пептонизирует. Характерен рост в столбике желатина: в виде «опрокинутой елочки», позже желатин воронкоооразно разжижается; на кровяном агape не дает гемолиза, чем отличается от сходных с ним почвенных и ложносибиреязвенных бацилл. Патогенетическими факторами возбудителя сибирской язвы являются его способность продуцировать экзотоксин и образовывать капсулу. С экзотоксином связывают воспалительное и летальное действие возбудителя. Обнаружено, что токсин также подавляет фагоцитарную активность лейкоцитов. Капсула препятствует фагоцитозу бацилл, способствуя проявлению действия основного патогенетического фактора — токсина. Токсин вызывает в организме повышение проницаемости сосудов, расстройство дыхания вследствие поражения центральной нервной системы, изменяет клеточный и химический состав крови.

Устойчивость. Вегетативные формы малоустойчивы: в трупе погибают в течение 1—3 сут, при 60°С — через 15 мин, а при 75°С — через минуту. Споры сибиреязвенных бацилл отличаются большой устойчивостью. Они сохраняются во внешней среде длительнее, чем все другие известные патогенные спорообразующие микробы. Выдерживают сухой жар 120—140°С в течение 2—3 ч, автоклавирование при 120°С — 5—10 мин. Дезинфицирующие растворы (сулема 1 : 1000, 5% раствор карболовой кислоты, 5—10% раствор хлорамина) убивают их только за несколько часов, а этиловый спирт в концентрациях от 25% до абсолютного — за 50 дней.

Антигенная структура. Возбудитель сибирской язвы содержит в клеточной стенке полисахаридный антиген и капсульный протеиновый антиген. К обоим антигенам в организме вырабатываются антитела, но защитными свойствами они не обладают. В организме животных и человека микроб образует особый протективный антиген, который обусловливает состояние иммунитета.

2. Отбор пат. материала

С целью личной безопасности отбор проб патологического материала выполняется в спецодежде и резиновых перчатках.

При подозрении сибирской язвы для постановки прижизненного диагноза у больного животного (кроме свиней) берут кровь из уха. Для этого участок кожи с хорошо выраженным сосудом тщательно дезинфицируют и, надрезав сосуд, наносят капли крови на обезжиренные предметные стёкла. Место надреза сосуда тщательно дезинфицируют. Затем, после подсушивания мазка, стёкла прокладывают спичками, плотно обёртывают пергаментной бумагой, перевязывают и помещают в герметичный полиэтиленовый пакет. Пакет помещают в термос. К данному материалу прилагают сопроводительный документ с указанием хозяйства, вида животного, даты отбора проб крови. В лаборатории мазки после окраски по Граму исследуют под световым микроскопом с целью обнаружения капсул и делают посевы на питательные среды.

У павшего животного при подозрении сибирской язвы также берут пробу крови. Если количества крови недостаточно, то проводят следующие манипуляции. Ухо со стороны, на которой лежал труп, перевязывают шпагатом в двух местах, ближе к основанию и отсекают между перевязкой. Места разреза прижигают калёным железом. Затем отрезанное ухо помещают в герметичный пакет и в термос. Вскрытие трупа недопустимо !Если вскрытие сделано, то с предосторожностью отбирают лимфатические узлы, кусочки селезёнки и печени, помещают в двойные герметичные полиэтиленовые пакеты и в термос. От свиней пробы крови не берут. В качестве патологического материала используют кусочки воспалённой ткани в области отёка и заглоточные лимфатические узлы.

Для исследования кожевенного сырья от каждой кожи отрезают участок величиной 3х3 см и надевают на бечёвку, маркируют и обеззараживают в камере Крупина при 0,7 атм. в течение 1 часа 45 минут.

Шерсть - не менее 10 образцов массой около 2 г каждый из разных мест упаковки. Образцы объединяют и упаковывают вместе.

3. Консервирование

При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с материалом помещают в герметичный металлический пенал (ящик), который опечатывают.

Транспортировку и хранение материала до исследования проводят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганизма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) помещают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиолоuического раствора или помещают в термос, содержащий: 1) снег или лед и поваренную соль (в соотношении 3: 1), температура смеси — 15 минус 20 °С; 2) равные части сухого льда и этанола, температура смеси около —70 °С.

Для бактериологического исследования патологический материал  (органы или их части) консервируют 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Воду предварительно стерилизуют кипячением или автоклавированием в течение 30 минут. Материал можно консервировать также в стерильном вазелиновом масле. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, в 4-5 раз превышающем его объем.

Небольшие трупы павших животных  (поросят, ягнят, телят), а также трупы мелких животных лучше посылать целыми в непроницаемой таре.

4. Факторы патогенности

К возбудителю сибирской язвы восприимчивы все виды млекопитающих. Чаще болеют овцы, крупный рогатый скот, лошади, козы, буйволы, верблюды и северные олени, могут заражаться ослы и мулы. Свиньи менее чувствительны. Среди диких животных восприимчивы все травоядные. Известны случаи заболевания собак, волков, лисиц, песцов, среди птиц - уток и страусов.

Важнейшим фактором вирулентности сибиреязвенной палочки является капсула. Утрата капсулы приводит к потере вирулентности. Капсула предохраняет В. anthracis от фагоцитоза. Другим важным фактором вирулентности, который ответствен за смерть животных, является сложный комплекс токсина, содержащего 3 различных компонента: фактор I, состоящий из белка и углевода; и два фактора чисто белковой природы (факторы II и III). Синтез сложного токсина контролируется плазмидой pXOl с м. м. 110-114 МД. В составе плазмиды pXOl есть три гена, определяющих синтез основных компонентов экзотоксина:

• ген суа - фактора отечности (ОФ);
• ген pag - протективного антигена (ПА);
• ген lef - летального фактора (ЛФ).

Продуктом гена суа (ОФ) является аденилатциклаза, катализирующая накопление в клетках эукариот цАМФ. Фактор отечности вызывает повышение проницаемости сосудов.

Протективный антиген индуцирует синтез защитных антител (однако наиболее иммуногенным является комплекс из всех трех компонентов обезвреженного токсина), летальный фактор вызывает смерть животных. Все три компонента токсина Действуют синергидно. Синтез капсулы сибиреязвенной палочки контролируется также плазмидой рХ02 с м. м. 60 МД.

5. Биопрепараты

Вакцина СТИ — живая вакцина из эталонного штамма, полученного Н. Н. Гинсбургом (1944), представляет собой споровую (95... 100 %) агаровую культуру в виде суспензии в 30%-м стерильном растворе глицерина; содержит (2,5...3,5) • 107 жизнеспособных спор в 1 мл. Вакцину контролируют на чистоту роста, концентрацию спор, безвредность на кроликах, иммуногенность на морских свинках.

Вакцина ГНКИ — сухая живая вакцина из эталонного штамма ГНКИ. Содержит 5 • 107 спор в 1 мл. Готовят и контролируют так же, как вакцину СТИ. Срок годности сухой вакцины 3 года.

Вакцина против сибирской язвы из штамма № 55.

Ассоциированная живая жидкая вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Лечебно-профилактическую сибиреязвенную сыворотку получают гипериммунизацией лошадей инактивированной сибиреязвенной культурой. Сыворотку проверяют на стерильность, безвредность на белых мышах и морских свинках, активность на кроликах. Также выпускают противосибиреязвенный глобулин.

Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка предназначена для исследования материала на сибирскую язву в реакции преципитации. Сыворотку получают гипериммунизацией лошадей.

Сибиреязвенный стандартный антиген для РП выпускают для контроля активности преципитирующей сыворотки. Представляет собой экстракт из инактивированной бактериальной массы В. anthracis.

Сибиреязвенные люминесцирующие сыворотки готовят из сибиреязвенной преципитирующей сыворотки; предназначены для ускоренного обнаружения некапсулированных клеток возбудителя в первичных посевах.

Сибиреязвенные диагностические бактериофаги представляя ют собой освобожденную от бактерий путем фильтрования жидкость бульонной культуры возбудителя, зараженную бактериофагом. Титр бактериофага 10.

6. Пункты плана диагностики

Из поступившего в лабораторию материала готовят мазки, окрашивают по Граму; одним из методов для выявления капсулы (методы Михина, Гимзы, Ольта и т. д.), а также сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками. В окрашенных мазках из трупного материала возбудитель обнаруживают в виде крупных грамположительных палочковидных бактерий, располагающихся одиночно, парами, короткими цепочками. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы закруглены, клетки окружены капсулой. В отдельных случаях, особенно в мазках из материала, полученного от свиней, форма клеток может быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые или зернистые палочки со вздутием в центре или на концевых частях бактерий.

Предварительный ответ в хозяйство, откуда поступил материал, дают немедленно по результатам микроскопического исследования.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Факульта­тивный анаэроб, температурный оптимум 35...37 "С, рН 7,2...7,4. С целью выделения культуры возбудителя исследуемый материал засевают в МПБ, на МПА или в бульон и агар Хоттингера и инкубируют в аэробных условиях 18...24 ч, а при отсутствии роста — до 48 ч.

На МПА anthracis формирует плоские, матово-серые, шероховатые, с отростками на краях колонии (R-форма), может образовывать и атипичные коло­нии без отростков. Края колоний R-формы под малым увеличением микроскопа имеют вид локонов, получивших название «львиная грива» . В МПБ рост возбудителя характеризуется образованием на дне пробирки рыхлого осадка при прозрачной питательной среде; после встряхивания осадок разбивается на хлопья. Если возбудитель выращивать на питательных средах, содержащих сыворотку крови, и в атмосфере с повышенным содержанием оксида углерода (IV), то на МПА образуются гладкие колонии S-формы, I и МПБ отмечают рост в виде диффузного помутнения среды.

В выросших культурах исследуют морфлогические и тинкториальные свойства клеток. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают длинные цепочки из грамположительных типичных палочек; в мазках из культур на средах с диффузным ростом находят отдельные или парные палочки. На бессывороточных средах бактерии капсулу не образуют, на сывороточных средах возбудитель формирует капсулу, причем клетки в препарате в последнем случае чаще располагаются одиночно или парами.

При значительной контаминации материала посторонней микрофлорой (сырье животного происхождения, объекты внешней среды) посев делают на селективный агар следующего состава: расплавленный МПА — 100 мл, сульфат полимиксина М — 0,5 мл, невиграмон — 0,5 мл, ризеофульвин — 1 мл, моющее средство «Прогресс» — 10мл, фенол фталеинфосфат натрия — 0,1 мл; перемешивают, разливают по чашкам Петри. Через 18...24 ч культивирования на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри наносят 1...2мл 25%-го водного раствора аммиака, чашку переворачивают. Колонии В. anthracis остаются бесцветными, колонии бактерий с фосфатазной активностью розовеют.

Биопроба. Заражение лабораторных животных исходным материалом — обязательный этап, проводимый сразу после поступления материала в лабораторию. Тканевой суспензией заражают подкожно двух белых мышей по 0,2...0,5 мл или морских свинок по 0,5...2 мл. Наблюдение ведут в течение 10 сут. При наличии возбудителя животные погибают обычно через 1...3сут. Павших животных исследуют с выделением культуры возбудителя.

Если в ходе указанных исследований выделена бактерия, типичная для В. anthracis по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам, патогенная для лабораторных животных, то дальнейшие исследования не проводят и диагноз считают установленным.

В случае получения нечетких результатов при вышеизложенных исследованиях проводят дополнительные с целью дифференциации выделенной культуры от сходных сапрофитных бацилл, и в первую очередь от В. cereus. При этом определяют способность микроорганизма к капсулообразованию путем посева на сывороточные среды, патогенность для лабораторных животных в биопробе, чувствительность к пенициллину, сибиреязвенному бактериофагу, специфичность к сибиреязвенным люминесцирующим сывороткам, гемолитическую активность, наличие жгутиков.

Тест «жемчужного ожерелья» разработан для определения чувствительности выделенного микроорганизма к пенициллину. В две колбочки (пробирки) с расплавленным МПА (температура 45 50 °С) добавляют пенициллин из расчета 0,05...0,5 ЕД/мл и переносят в две чашки Петри, в третью чашку наливают обычный МПА. После застывания агара из него вырезают пластинки размером 1,5 см2, которые переносят на предметные стекла и помещают в чашки Петри. На каждую пластинку бактериологической петлей наносят исследуемую 3-часовую бульонную культуру. Чашки выдерживают 1...3ч в термостате. Затем посевы просмат­ривают под микроскопом с объективом х 40 и иммерсионной системой. Перед просмотром зону роста накрывают покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином приобретают шаровидную форму, а цепочки — вид «жемчужного ожерелья». Спорообразующие сапрофитные аэробы в аналогичных условиях растут в обычной форме. На агаре без пенициллина сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки из типичных палочек.

Для определения чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу культуру или материал засевают на скошенный МПА, затем на поверхность среды наносят каплю бактериофага в рабочем титре и посевы выдерживают при температуре 37...38°С 24 ч. В случае принадлежности культуры к В. anthracis на поверхности МПА в зоне нанесения бактериофага остается стерильная зона при наличии роста микроорганизма на остальных участках среды. Для идентификации В. anthracis методом люминесцирующих антител используют флуоресцирующую адсорбированную сыворотку, не дающую перекрестных реакций с антигенно-родственными сапрофитными бациллами.

Гемолитическую активность исследуемой культуры определяют посевом на 5%-й МПА или в МПБ.

Наличие жгутиков исследуют посевом в 0,3%-й МПА или методом «раздавленной капли».

Если для исследования поступил загнивший материал, который нельзя подвергать обычному бактериологическому исследованию, то диагноз ставят на основании обнаружения антигенов возбудителя в материале при помощи реакции кольцевой преципитации.

Материал экстрагируют физиологическим раствором (соотношение 1:10) путем кипячения в течение 30...40 мин (горячий способ). Экстракцию смеси тканевой суспензии и карболизированного физиологического раствора (соотношение 1 : 10) можно проводить в течение 16... 18 ч при комнатной температуре (холодный способ). Экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют в РП.

Реакцию ставят методом «наслаивания» или «подслаивания». При   «наслаивании»  в  преципитационную  пробирку  вносят 0,2...0,3 мл преципитирующей сыворотки и осторожно наливают (наслаивают) исследуемый экстракт таким образом, чтобы компоненты не перемешивались. При «подслаивании» в пробирку вначале вносят 0,2...0,3 мл экстракта, затем под него пастеровской пипеткой — равное количество сибиреязвенной преципитирующей сыворотки. Одновременно ставят контроли. Реакцию считают положительной, если через 1...2мин и не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появился тонкий беловатый диск преципитации.

В ветеринарных лабораториях часто исследуют на сибирскую язву в РП кожевенно-меховое сырье. В лабораторию доставляют пробы кожевенного сырья в виде небольших квадратиков (или кружков), взятых от шкур в местах, вырез которых не снижает товарной ценности. Эти пробы нанизывают на тонкую проволоку в том порядке, в котором шкуры расположены на складе. Поступившие пробы обязательно стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм. 30 мин. Затем пробы измельчают и берут навески: 1 г — от парного, мороженого, пресно-сухого и сухосоленого сырья и 2 г —от мокросоленого. Пробы заливают экстрагирующей жидкостью (физиологический раствор, содержащий 0,3 % кристаллического фенола).

Пробы сырья от всех видов животных экстрагируют холодным способом при комнатной температуре в течение 16...20 ч; пробы от свиных шкур кипятят 30 мин. Экстракты фильтруют через асбестовую вату до прозрачности (предварительно взболтав содержимое баночек с пробами). Компоненты соединяют методом «наслаивания» или «подслаивания».

Контроли РП. 1. Контроль преципитирующей сыворотки: а) со стандартным сибиреязвенным антигеном (результат положительный в течение 1...2 мин); б) с экстрактом из заведомо благополучных боенских кож (результат отрицательный в течение 1 ч); в) с экстрагирующей жидкостью (результат отрицательный в течение 1ч). 2. Контроль асбестовой ваты на нейтральность (при поступлении каждой новой партии асбестовой ваты).

Учет результатов РП проводят через 10... 15 мин для пресно-сухого (одиночные пробы), через 30 мин —для пресно-сухого (сдвоенные пробы) и сухосоленого (одиночные пробы), через 60 мин — для сухосоленого (сдвоенные пробы) и мокросоленого сырья.

При исследовании на сибирскую язву свежего тканевого мате­риала, а также при идентификации выделенных культур можно использовать реакцию диск преципитации, которая основана на взаимодействии продуктов метаболизма возбудителя (антиген), растущего в жидкой питательной среде, с антителами преципитирующей сибиреязвенной сыворотки.

В стерильную бактериологическую пробирку вносят 0,5... 1 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, на ее поверхность осторожно (по стенке пробирки) наслаивают расплавленный (45...50°С) 1%-й агаровый гель столбиком высотой 5...7 мм. Далее на поверхность застывшего агара наливают 1... 1,5 мл жидкой питательной среды (МПБ, среда ГКИ и т. д.) и в нее делают посев исследуемого тканевого материала или идентифицируемой культуры микроорганизма.

Посевы выдерживают при 37...38 °С 16...20 ч. Результаты учитывают, просматривая пробирку в проходящем свете на черном фоне. В положительном случае в средней части столбика агароного геля обнаруживают тонкую белую четкую линию (диск) пре­ципитации. Сапрофитные бациллы при росте в этой системе преципитации не дают. Некоторые штаммы В. cereus могут вызывать в нижней части агарового столбика образование рыхлой толстой зоны преципитации, которая за 30...40ч разрыхляется и сливается с преципитирующей сывороткой.

Список используемой литературы

1.    .Н. Кисленко «Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии»; Москва, «Колос», 2005 г.

2.    В.В.Кузьмин «Ветеринарная микробиология»; Москва,  1950 г.

3.    Т.С.Костенко, В.Б.Родионова, Д.И.Скородумов «Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии»; Москва, «Колос», 2001 г.

4.    Д. И. Скородумов, В. В. Субботин, М. А. Сидоров, Т. С. Костенко. «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных», 2005 г.

5.    http://medicalplanet.su